Derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas: un procedimiento para la diferenciación dirigida de podocitos renales maduros a partir de células madre

1. Preparación de reactivos

1. Diluir el suplemento de medios de cultivo celular (CCM) hiPS descongelados 5x en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM.
   nota: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente a 4 °C durante toda la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM pueden almacenarse hasta 6 meses a -20 °C.
2. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para el cultivo de células hiPS: Descongele la matriz BM 1 durante la noche en hielo a 4 °C. Una vez descongelados, prepare las alícuotas con los factores de dilución adecuados según lo sugerido por el fabricante.
   nota: Normalmente, las alícuotas se preparan para su posterior dilución en 25 mL de DMEM/F12 frío en un tubo cónico de 50 mL, seguido de una mezcla completa para disolver completamente la matriz BM 1 y evitar la formación de cristales residuales.
3. Transfiera 1 mL de la solución de la matriz BM 1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incube a 37 °C durante 1-2 h o a 4 °C durante un mínimo de 24 h, envuelto en una película de parafina. Las placas recubiertas de matriz BM 1 pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
4. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 2: Diluir cantidades apropiadas de matriz BM 2 en agua destilada estéril de 9 mL para preparar una concentración final de 5 μg/mL. Añada 700 μL de la solución BM matrix 2 a cada pocillo de una placa de 12 pocillos e incube la placa a temperatura ambiente durante 2 h o toda la noche a 4 °C.
5. Prepare 100 μg/ml de soluciones madre de BMP7, Activina A y VEGF de la siguiente manera: Reconstituya BMP7 en agua destilada estéril que contenga 0,1% (peso/vol) de BSA y reconstituya Activina A y VEGF por separado en PBS estéril que contenga 0,1% (peso/vol) de BSA. Para evitar ciclos frecuentes de congelación y descongelación, prepare 100 μL de alícuotas de cada solución madre y almacene a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
6. Prepare una solución madre de 10 mM de Y27632 disolviendo 10 mg de Y27632 en 3,079 mL de agua destilada estéril. Aliquot 100 μL del stock y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
7. Disuelva 2 mg de CHIR99021 en 143,4 μL de DMSO estéril para preparar una solución madre de 30 mM. Prepare 5 μL de alícuotas y almacene a -20 °C durante un máximo de 1 mes (o según la recomendación del fabricante).
8. Disuelva 10 mg de ácido retinoico trans en 3,33 ml de DMSO estéril. Prepare 500 μL de alícuotas y almacene a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

>2. Preparación de los medios de cultivo

1. Prepare el medio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de Activina A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 y 1x suplemento sin suero B27 en un volumen adecuado de DMEM/12 con suplemento de glutamina.
   nota: El medio de diferenciación del mesodermo debe estar recién preparado antes de los pasos de diferenciación y a un volumen apropiado para la escala del experimento (por lo general, 50 mL de medio son adecuados para dos placas de 12 pocillos).
2. Prepare el medio de diferenciación del mesodermo intermedio reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de BMP7, 3 μM CHIR99021 y 1x suplemento sin suero B27 en DMEM/F12 con un suplemento de glutamina.
   nota: Si es necesario, el medio se puede complementar con penicilina-estreptomicina al 1% (vol/vol). Ajuste el volumen del medio mediante el uso de DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Este medio se puede preparar en grandes lotes; sin embargo, se recomienda almacenar en alícuotas más pequeñas (por ejemplo, 45 mL en tubos cónicos de 50 mL) para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Este medio se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 3 meses y se puede descongelar a 4 °C durante la noche antes de su uso.
3. Prepare el medio de inducción de podocitos reconstituyendo a una concentración final 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL de activina A, 50 ng/mL de VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento sin suero B27 y 0,1 μM de ácido transretinoico en DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Proteja el medio de la luz (por ejemplo, envolviendo el recipiente con papel de aluminio).
   nota: Este medio puede prepararse en grandes lotes y almacenarse en la oscuridad a -20 °C durante un máximo de 3 meses. Las alícuotas congeladas deben descongelarse durante la noche a 4 °C antes de su uso.
4. Prepare 25 mL de solución neutralizante de tripsina agregando FBS inactivado por calor al 10% (vol/vol) en DMEM/F12 y filtre en condiciones estériles.
5. Para el mantenimiento posterior a la diferenciación de los podocitos derivados de células madre, prepare Complete Medium con medios de mantenimiento de podocitos añadiendo el suplemento al medio basal según las directrices del fabricante, y almacene a 4 °C durante un máximo de dos semanas.

>3. Cultivo de células hiPS sin alimentador utilizando medio de cultivo celular hiPS

1. Aspire la solución residual de la matriz BM 1 de las placas prerrevestidas y lave los pocillos 3 veces con 1 a 2 mL de DMEM/F12 calentado.
2. Aspire el CCM hiPS gastado de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM/F12 calentado. Añadir 1 mL de solución tibia de desprendimiento de células e incubar durante 1 min a 37 °C para ayudar a disociar las células. Realice una inspección visual de las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos y asegúrese de que los bordes de las colonias celulares aparezcan redondeados, luego aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular de las células (asegurándose de que las colonias celulares aún estén unidas a la placa, aunque sin apretar). Enjuague suavemente las células una vez con DMEM/F12 para eliminar la solución de desprendimiento de células.
3. Agregue 3 mL de hiPS CCM a las células hiPS (en cada pocillo de una placa de 6 pocillos) que fueron tratadas con la solución de desprendimiento de células. Raspe las colonias con un elevador de células y pipetee suavemente la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para desalojar las células poco adheridas. Lave bien la placa para asegurarse de que se recojan todas las células.
   nota: Se recomienda el uso de una pipeta de 5 ml para evitar el exceso de cizallamiento en las células.
4. Transfiera 0,5 mL de la suspensión celular a cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos recubierta con 1 matriz BM que contenga 2 mL de CCM hiPS por pocillo. Mueva la placa en forma de ocho para distribuir las colonias celulares dentro de los pocillos e incubar a 37 °C en una incubadora de 5 % de CO₂. Refresque el medio diariamente hasta que las células estén listas para ser pasadas o utilizadas para el experimento de diferenciación (aproximadamente 70 % de confluencia).
   nota: El tamaño ideal de la colonia para el paso rutinario de iPSC es de entre 200 y 500 μm en condiciones sin alimentador utilizando hiPS CCM (sin inhibidor de ROCK). Si las células se individualizan durante el tratamiento con enzimas de disociación o tampones, el hiPS CCM se puede complementar con un inhibidor de ROCK (por ejemplo, 10 μM Y27632) para mejorar la viabilidad celular.

>4. Diferenciación de células hiPS en células mesodermas (días 0-2)

1. Mientras que los cultivos de células hiPS se encuentran en la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente dentro de los 4 días posteriores al cultivo después del paso, y alrededor del 70% de confluencia), inspeccione visualmente la presencia de células diferenciadas espontáneamente dentro y alrededor de los bordes de las colonias. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación.
2. Aspire hiPS CCM de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM/F12 tibio. Incubar las células con 1 mL de tampón de disociación celular libre de enzimas durante 10 min a 37 °C y comprobar la disociación al microscopio. Debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas celulares de hiPS, el tiempo de incubación real para el tampón de disociación celular debe determinarse para una línea celular determinada.
3. Raspe suavemente el pocillo con un elevador de células para desalojar las células poco adheridas y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL, seguido de un pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces para individualizar las células hiPS.
   1. Lleve la suspensión celular al volumen de 15 mL con DMEM/F12 caliente y centrifugue durante 5 min a 290 x g a temperatura ambiente.
   2. Aspire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con DMEM/F12 caliente para otra ronda de centrifugación para eliminar los componentes residuales de la matriz BM 1 y del tampón de disociación.
4. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de medio de inducción de mesodermo como se describió anteriormente. Cuente el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de rejas para determinar el volumen apropiado de medio de diferenciación del mesodermo necesario para lograr una concentración de 1 x 10⁵ células/mL.
5. Aspire la solución de ECM de las placas recubiertas de BM matrix 2 y enjuague las placas dos veces con DMEM/F12 tibio. Mezcle suavemente la suspensión de células hiPS pipeteando unas cuantas veces. Transfiera 1 mL de la suspensión celular a cada pocillo de las placas de 12 pocillos recubiertas de 2 pocillos de la matriz BM y luego agite suavemente las placas para distribuir las celdas de manera más uniforme.
6. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂. Refrescar el medio de inducción del mesodermo al día siguiente.
   nota: Después de 2 días, las células del mesodermo derivadas de células hiPS estarían listas para la inducción del mesodermo intermedio.

>5. Diferenciación de células mesodermas derivadas de células hiPS en mesodermo intermedio (días 2-16)

1. En el día 2 del protocolo de diferenciación, aspire el medio de inducción del mesodermo y reponga con 1 mL por medio de inducción del mesodermo intermedio del pocillo.
2. Refresh medium todos los días para mantener un umbral preciso de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para las células metabólicamente activas. Si hay un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes del medio (indicado por el color amarillento del medio), el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 mL por pocillo de las placas de 12 pocillos.
3. Cultive células durante 14 días adicionales para obtener células del mesodermo intermedio. Para el día 16, estas células pueden ser criopreservadas para su uso posterior.

>6. Diferenciación de células del mesodermo intermedio derivadas de células hiPS en podocitos (días 16-21)

1. Enjuague las células del mesodermo intermedio con DMEM/F12 tibio, seguido de la incubación de las células con 0,5 mL por pocillo de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 3 min a 37 °C. Realice una inspección visual para asegurarse de que las células están comenzando a disociarse.
2. Raspe las células con un elevador de células y pipetee la suspensión celular varias veces con una punta de pipeta de 1.000 μL para obtener células individualizadas (o pequeños grupos de ellas)
   nota: En esta etapa, asegúrese de que las células estén completamente disociadas, ya que es posible que las células agregadas no adquieran un fenotipo terminalmente diferenciado dentro de la línea de tiempo del protocolo.
3. Agregue aproximadamente 2 mL por pocillo de solución neutralizante de tripsina para detener la actividad de la tripsina.
4. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mL y aumente el volumen hasta 50 mL utilizando DMEM/F12, y luego centrifugue la suspensión de la celda durante 5 min a 201 x g a temperatura ambiente.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de inducción de podocitos. Para obtener resultados óptimos, asegure una densidad de siembra final de aproximadamente 100.000 células/pocillo de una placa de 12 pocillos. Agregue la suspensión celular a las placas recubiertas de BM matrix 2 y agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las celdas de manera más uniforme.
6. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ y refrescar el medio diariamente durante un máximo de 5 días para obtener podocitos a las 21.
   nota: Los podocitos derivados de células hiPS resultantes se pueden mantener en cultivo durante 2-4 semanas adicionales mediante el uso de medio completo con medios de mantenimiento de podocitos. Una vez en el medio de mantenimiento de los podocitos, las células pueden alimentarse cada dos días y pueden utilizarse para estudios posteriores o análisis posteriores.