Aislamiento de células de músculo liso detrusor: un procedimiento de digestión enzimática para obtener células DSM a partir de muestras de vejiga urinaria humana

Resumen

Fuente: Malysz, J. et al. Preparación y Utilización de Células de Músculo Liso Detrusor Humano Recién Aisladas para la Caracterización de Corrientes Catiónicas Sensibles al 9-Fenantropl. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el aislamiento de células de músculo liso detrusor de muestras de vejiga urinaria humana utilizando un tratamiento enzimático secuencial de dos pasos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

>1. Disección de tejidos DSM y preparación de piezas DSM libres de mucosa

1. Examinar la muestra de vejiga urinaria de espesor completo que llegó al laboratorio desde el quirófano en un recipiente herméticamente sellado lleno de la solución fría de disección/digestión (Figura 1 y Tabla 1 para la composición de DS)
   nota: Por lo general, el espécimen se mantiene en DS frío desde unas pocas horas hasta toda la noche antes de su llegada al laboratorio. Para un almacenamiento más prolongado, DS (Tabla 1) se complementa con 1 mM de CaCl₂.
2. Retire y enjuague la muestra DSM de espesor completo humano (que contiene todas las capas, incluidas la mucosa, DSM y serosa) con DS helado para lavar los residuos y la sangre adheridos.
3. Sujete con alfileres la muestra de vejiga urinaria, con la mucosa hacia arriba y serosa hacia abajo, en un plato redondo de 150 mm de diámetro recubierto de enantiómero de silicona (Tabla de Materiales) lleno de DS helado (Figura 1B).
4. Extraer el tejido adiposo adyacente, los vasos sanguíneos, el epitelio (urotelio) y la mucosa muscular de la muestra mediante una disección aguda con microtijeras y fórceps.
5. Corte varias piezas DSM libres de mucosa (~2-3 mm de largo y 4-6 mm de ancho) (Figura 1C).

>2. Disociación enzimática de piezas del DSM que producen células individuales del DSM recién aisladas

1. Coloque de 3 a 6 piezas de DSM en un tubo que contenga de 1 a 2 mL de DS precalentado (~37 °C) que contenga papaína y ditiotreitol (DS-P, Tabla 1) e incube las piezas de DSM en DS-P durante 30-45 min a ~37 °C agitando suavemente el tubo de vez en cuando (una vez cada 10-15 min).
   nota: Para controlar de manera óptima la temperatura para el tratamiento enzimático, los tubos con piezas de tejido y soluciones enzimáticas se colocan en una cámara de tejido de vidrio llena de agua conectada a un baño de agua caliente circulante (Figura 1D) o en un baño de agua agitada de temperatura controlada de alta precisión (Figura 1E).
2. Retire el DS-P del tubo, lave brevemente las piezas de DSM con DS helada, deseche las DS frías del tubo dejando las piezas de DSM en el fondo del tubo.
3. Añadir de 1 a 2 mL de colagenasa tipo II QUE CONTIENE DS (DS-C, Tabla 1) al tubo con trozos de DSM; mezclar e incubar suavemente durante 25-40 min a ~37 °C agitando suavemente el tubo de vez en cuando (cada 10-15 min).
4. Deseche el DS-C y lave las piezas de DSM tratadas con enzimas de 5 a 10 veces con DS helado.
5. Después del último lavado, deje la solución DS dentro del tubo; triture suavemente con una pipeta Pasteur pulida al fuego varias veces para liberar células DSM individuales.
6. Coloque unas gotas de solución DS que contenga células DSM dispersas en una cámara con fondo de vidrio o en un cubreobjetos e inspeccione visualmente la calidad bajo un microscopio (usando un objetivo de 20x o 40x) después de al menos 5 minutos después de la aplicación para permitir que las células se adhieran al fondo.
7. Utilice inmediatamente las células DSM recién aisladas para experimentos electrofisiológicos o almacene las células en un tubo que contenga DS a ~4 °C, ya sea en hielo o en un refrigerador hasta su uso (normalmente hasta 8 h de preparación).
   nota: Dentro de la misma preparación, la calidad de las células varía desde células DSM muertas altamente viables hasta células muertas y sobredigeridas (Figura 2). Cuando el método secuencial de papaína-colagenasa produce un número muy alto de células inviables, se descarta la preparación y se realiza una nueva digestión de las piezas de DSM pero con intervalos de incubación reducidos. Si el procedimiento da como resultado muy pocas células DSM, entonces para la digestión posterior de las piezas DSM, se aumentan los intervalos de incubación. La inmunorreactividad positiva a la actina del músculo liso α confirma la identidad de las células DSM (Figura 3).

Tipo de solución	Composición (en mM)
DS (Solución de disección/digestión)	80 Na-glutamato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 y 11 glucosa, pH ajustado a 7,4 (con 10 M de NaOH)
DS-P (DS que contiene papaína)	DS que contiene 1-2 mg/ml de papaína, 1 mg/ml de ditiotreitol y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina
DS-C (DS que contiene colagenasa)	Solución DS que contiene 1-2 mg/ml de colagenasa tipo II, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina, 0 o 1 mg/ml de inhibidor de tripsina y 100-200 μM de Ca2+
P (pipeta)	110 CsOH, 110 ácido aspártico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA y 30 CsCl, pH ajustado a 7,2 con CsOH y suplementado con anfotericina-B (300-500 μg/ml)
E (Extracelular)	10 cloruro de tetraetilamonio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES y 10 glucosa, pH ajustado a 7,3-7,4 con NaOH o CsOH, y 0,002-3 (2-3 mM) de nifedipino

Tabla 1: Composiciones de la solución de disección/digestión (DS) y de las soluciones de pipeta y extracelulares utilizadas en los experimentos de patch-clamp perforado.

Resultados

Figura 1: Resumen de los pasos de disección que dieron lugar a la preparación de las piezas de músculo liso del detrusor (DSM) y la configuración utilizada para la disociación enzimática. Se muestran imágenes de: (A) una muestra de vejiga urinaria humana de espesor completo proporcionada por una cirugía de vejiga abierta como material quirúrgico extraño en DS helado,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo	halcón	352054	Tubos para DS que contienen enzimas utilizadas en las etapas de la digestión
Mezclador de vórtice analógico	VWR	58816-121
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016	Solución extracelular y DS
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Quelante de Ca2+, utilizado en solución de pipeta intracelular
glucosa	sigma	G8270
Colagenasa tipo 2	Corporación Bioquímica de Worthington	LS004177	DS-C
Hidrato de hidróxido de cesio	Sigma-Aldrich	C8518	Solución de pipeta intracelular
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluciones extracelulares e intracelulares
DL-ditiotritol (DDT)	Sigma-Aldrich	D9779	Agentes reductores utilizados junto con la papaína
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipino	Sigma-Aldrich	N7634	Bloqueador de canal de Ca2+ con dependiente de voltaje tipo L
Bastidor/soporte de tubo de espuma flotante	VWR Scientific	82017-634	Se utiliza para sujetar tubos con enzimas para el control de temperatura
Ácido glutámico (sal de Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
papaína	Corporación Bioquímica de Worthington	LS003126	DS-P
MgCl2 (hexahidratado)	Sigma-Aldrich	M2670	Soluciones extracelulares e intracelulares
Kcl	Fisher Científico	BP366-1	Solución extracelular
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluciones extracelulares e intracelulares
Aguja de jeringa no metálica, MicroFil	WPI (en inglés	MF-34G-5	Llenado de solución de pipeta intracelular
Pipeta Pasteur	FisherBrand (Marca Pescadora)	13-678-20A	Las puntas se rompen y se pulen al fuego y se utilizan para la valoración de tejidos tratados enzimáticamente para liberar células DSM individuales de piezas
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampón de pH
Baño de agua agitable Thermo Scientific Precision (modelo 2870)	Termo Científico	terminado	Baño de agua para el control de la temperatura de la digestión enzimática empleado como alternativa a la configuración del baño de circulación de la cámara de tejido
Tubo de vinilo	ColePalmer	06405-3	Múltiples usos, incluso para conectar el baño de tejido al baño de agua circulante
Bañera circuladora de agua, Haake D1 L	Haake	terminado	Conectado al baño de tejidos
Microscopio invertido ZeissAxiovert 40C con objetivos de 10x y 40x	Carl-Zeiss	terminado	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche

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