Análisis de patch-clamp perforado mediado por anfotericina-B: una técnica electrofisiológica para estudiar las corrientes iónicas en las células de la vejiga urinaria

Abstract

Fuente: Malysz, J. et al. Preparación y Utilización de Células de Músculo Liso Detrusor Humano Recién Aisladas para la Caracterización de Corrientes Catiónicas Sensibles al 9-Fenantropl. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la caracterización de las corrientes catiónicas de los canales iónicos de melastatina tipo 4 (TRPM4) con potencial transitorio en células de músculo liso detrusor utilizando la técnica de patch-clamp perforado mediada por anfotericina-B. La técnica ayuda a evaluar las propiedades biofísicas y farmacológicas de los canales iónicos.

Protocol

>1. Registro de corrientes catiónicas inducidas por pasos de voltaje de celdas DSM utilizando la técnica de parche de voltaje de celda completa perforada con anfotericina-B

1. Pipetear 0,25–1 mL de suspensión celular en una cámara con fondo de vidrio colocada sobre una platina de un microscopio invertido y permitir que las células se adhieran al fondo de vidrio.
2. Después de la incubación durante al menos 45 minutos, retire la solución de digestión (DS) del baño y reemplácela con la solución E (Tabla 1) por superfusión, donde el flujo de solución asistido por gravedad a través del tubo de entrada reemplaza lentamente el DS con la nueva solución><, mientras que el tubo de salida conectado a un recipiente de desechos al vacío elimina la solución de la cámara y evita el desbordamiento. nota: La solución E contiene iones tetraetilamonio (TEA⁺) y cesio (Cs⁺) para inhibir las corrientes de K⁺.
3. Prepare una solución madre de trabajo de anfotericina-B en dimetilsulfóxido (DMSO) (1 mg por 10 μL de DMSO). Para disolver completamente el polvo de anfotericina, sonicar (al menos 15 min) y vortear bien la solución.
   nota: Este paso suele tardar menos de 10 minutos. Disolver 3-4 mg de anfotericina-B en 30-40 μL de DSMO en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL funciona bien. Cantidades más altas de anfotericina-B requieren más solvente DSMO, lo que generalmente resulta en un intervalo más largo para la mezcla y una solubilización incompleta de las partículas sólidas de anfotericina-B presentes en el tubo.
4. Disuelva la solución madre de anfotericina-B en la solución de pipeta (solución P, Tabla 1) para obtener una concentración final de 200-500 μg/mL. Este paso requiere una amplia sonicación y vórtice a un ajuste de alta velocidad (8-10/10) durante ~30 a 60 min por paso para garantizar una mezcla óptima y evitar la formación de precipitado de anfotericina-B en la solución de pipeta.
   nota: La anfotericina-B precipitará con el tiempo y es sensible a la luz. La solución de pipeta de trabajo que contiene anfotericina-B se comprueba para comprobar su solubilidad, se mezcla a mano antes del llenado de la pipeta y se mantiene en la oscuridad.
5. Tire de varios electrodos de parche, pula al fuego las puntas de los electrodos y (si es necesario) cubra las puntas con cera dental.
6. Llene la punta de un electrodo de parche con la solución de pipeta (solución P, Tabla 1) sin anfotericina-B sumergiendo brevemente el electrodo en la solución.
7. Rellene el electrodo con la misma solución de pipeta que contiene anfotericina-B.
8. Monte el electrodo en un soporte conectado a una etapa de amplificador de abrazadera de parche.
9. Con un micromanipulador, coloque el electrodo justo debajo de la superficie de la solución extracelular de modo que la punta del electrodo quede sumergida.
10. En el modo de pinza de voltaje, establezca el potencial de retención en 0 mV y ajuste la corriente a 0 pA con el dial de compensación de pipeta en el amplificador comercial (Tabla de materiales).
11. Determine la resistencia del electrodo utilizando la ventana/función de prueba de membrana del software de adquisición comercial (Tabla de materiales). Para activarlo, haga clic en Herramientas>Prueba de membrana>Reproducir o en un icono de acceso directo en el software. La resistencia del electrodo determinada debe estar en el rango de 2 a 5 MΩ.
    nota: La función de prueba de membrana proporcionada en el software de adquisición comercial o la opción de prueba de sellado en el amplificador se puede utilizar para monitorear la resistencia del electrodo mediante la aplicación repetitiva de pasos de voltaje.
12. Continúe monitoreando la resistencia del electrodo mientras avanza el electrodo hacia una celda DSM elegida con un micromanipulador (Figura 1A).
    nota: Para ser considerada una célula DSM viable, la célula debe mostrar una morfología alargada en forma de huso, un halo bien definido alrededor de la célula, bordes nítidos y apariencia semicontráctil (serpentina).
13. Al tocar la superficie de la celda con el electrodo, indicado por un rápido aumento en la resistencia del electrodo medido con la función de prueba de membrana, forme un giga-sello aplicando una presión negativa suave y rápida al soporte del electrodo a través de un tubo. Esto da como resultado la creación de una presión negativa en la punta del electrodo que tira de la membrana celular hacia el electrodo, lo que ayuda a la formación de un giga-sello o un contacto muy estrecho entre el electrodo y la membrana plasmática (Figura 1B).
14. Una vez que se forme el giga-sello, compense la capacitancia de la pipeta ajustando los diales rápidos y lentos en el amplificador comercial y controle la estabilidad del giga-sello (corriente de fuga) mediante la función de prueba de membrana.
15. Deje tiempo, normalmente de 30 a 60 minutos, para que la anfotericina-B se difunda por la pipeta y se inserte en la membrana plasmática formando poros principalmente selectivos a cationes monovalentes. Durante este paso, continúe monitoreando el giga-seal con la función de prueba de membrana. A medida que aumenta la perforación de la celda, también lo hace la amplitud de los transitorios de capacitancia (compare la Figura 1B con la Figura 1C que muestra una perforación de celda efectiva y nula, respectivamente) medida con la función de prueba de membrana.
16. Cuando la perforación del parche es óptima (juzgada por una resistencia en serie estable típicamente por debajo de 50 MΩ), cancele los transitorios de capacitancia ajustando los diales para la capacitancia de la celda y la resistencia en serie en el amplificador. La compensación de resistencia en serie también se puede realizar en este momento (Figura 1D).
17. Una vez que se observan las corrientes catiónicas inducidas por paso de voltaje estables evocadas por el protocolo especificado, aplique una condición compuesta o fisiológica para probar por superfusión y registre las respuestas para el control, la condición de prueba y el lavado (si es posible) con el software de adquisición comercial.
    1. Registre las corrientes con un protocolo de paso de voltaje de rutina que implica mantener las celdas DSM a -64 o -74 mV y aumentar el voltaje en incrementos de 10 mV durante 400 o 500 ms de -94 a +96 o +106 mV y volver al potencial >nota: Los valores de potencial de membrana se ajustan para un potencial de unión líquida de 14 mV (utilizando soluciones P y E, Tabla 1). El potencial de unión líquida se obtiene en el software de adquisición comercial (Tabla de materiales) haciendo clic en Herramientas>Potenciales de unión e ingresando las concentraciones de los componentes del ion solución. También se puede utilizar un protocolo de rampa para obtener las grabaciones actuales.
    2. Ejecute el protocolo de voltaje en un intervalo continuo de ~ 1 minuto durante un experimento registrando corrientes para el control de preadición, la condición de prueba y el lavado

Tipo de solución	Composición (en mM)
DS (Solución de disección/digestión)	80 Na-glutamato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 y 11 glucosa, pH ajustado a 7,4 (con 10 M de NaOH)
DS-P (DS que contiene papaína)	DS que contiene 1-2 mg/ml de papaína, 1 mg/ml de ditiotreitol y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina
DS-C (DS que contiene colagenasa)	Solución DS que contiene 1-2 mg/ml de colagenasa tipo II, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina, 0 o 1 mg/ml de inhibidor de tripsina y 100-200 μM de Ca2+
P (pipeta)	110 CsOH, 110 ácido aspártico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA y 30 CsCl, pH ajustado a 7,2 con CsOH y suplementado con anfotericina-B (300-500 μg/ml)
E (Extracelular)	10 cloruro de tetraetilamonio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES y 10 glucosa, pH ajustado a 7,3-7,4 con NaOH o CsOH y 0,002-3 (2-3 mM) de nifedipino

Tabla 1: Composiciones de la solución de disección/digestión (DS) y de las soluciones de pipeta y extracelulares utilizadas en los experimentos de patch-clamp perforado.

Results

Figura 1: Ilustración esquemática de los pasos involucrados en la formación de giga-seal y la perforación de anfotericina-B de células DSM humanas. Se ilustran las posiciones espaciales de una pipeta que contiene anfotericina-B y una celda DSM, junto con las respuestas asociadas para las pruebas de membrana obtenidas en el software de adquisición comercial (Tabla de materiale...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo	halcón	352054	Tubos para DS que contienen enzimas utilizadas en las etapas de la digestión
Anfotericina-B	pescador	BP928-250	Se utiliza para la perforación de parches/células
Anfotericina-B	Normas de referencia de la Farmacopea Europea	5	Se utiliza para la perforación de parches/células
Anfotericina-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Se utiliza para la perforación de parches/células
Mezclador de vórtice analógico	VWR	58816-121
Ácido aspártico	Sigma-Aldrich	A9006	Solución de pipeta intracelular
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	Solución extracelular y DS
Vidrio capilar	Sutter	BF150-110-7.5	Capilar para la preparación de electrodos de parche extraídos
Hidrato de hidróxido de cesio	Sigma-Aldrich	C8518	Solución de pipeta intracelular
El software Clampex versión 10 incluye programas de adquisición de datos (Clampex) y análisis (Clampfit)	Instrumentos Axon/ Dispositivos Moleculares	pCLAMP-10	Software comercial y parte de la configuración del equipo de patch-clamp
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluciones extracelulares e intracelulares
Cera dental	Miltex Tecnologías de Cera Dental, Inc.	18058351
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	solvente
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Quelante de Ca2+, utilizado en solución de pipeta intracelular
Extractor de micropipetas aplanado/marrón	Sutter	P-97	Necesario para tirar de electrodos con puntas muy finas
Bastidor/soporte de tubo de espuma flotante	VWR Scientific	82017-634	Se utiliza para sujetar tubos con enzimas para el control de temperatura
glucosa	sigma	G8270
Ácido glutámico (sal de Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampón de pH
Kcl	Fisher Científico	BP366-1	Solución extracelular
Sistema de adquisición de datos de bajo ruido	Instrumentos Axon/ Dispositivos Moleculares	Digidata 1440A	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche
Agitador magnético	VWR	01-442-684
MgCl2 (hexahidratado)	Sigma-Aldrich	M2670	Soluciones extracelulares e intracelulares
MicroForge	Narishige	MF-830	Se utiliza para electrodos de pulido al fuego
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluciones extracelulares e intracelulares
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipino	Sigma-Aldrich	N7634	Bloqueador de canal de Ca2+ con dependiente de voltaje tipo L
Microscopio invertido Nikon, TS100 con platina T1-SM con objetivos de 5x, 10x, 20x y 40x	Nikon	terminado	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche
Aguja de jeringa no metálica, MicroFil	WPI (en inglés	MF-34G-5	Llenado de solución de pipeta intracelular
Pipeta Pasteur	FisherBrand (Marca Pescadora)	13-678-20A	Las puntas se rompen y se pulen al fuego y se utilizan para la valoración de tejidos tratados enzimáticamente para liberar células DSM individuales de piezas
Amplificador de abrazadera de parche	Instrumentos Axon/ Dispositivos Moleculares	Axon Axopatch 200B	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche
Ordenador PC	Dell	Configuración personalizada	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche
Medidor de pH	Instrumentos Aspera	PH700
Tubo de polietileno	Intramédico	427-436	Tubo para la superfusión del baño extracelular conectado a la cámara de registro con fondo de vidrio
Cloruro de tetraetilamonio	Sigma-Aldrich	T2265	Bloqueador de canales iónicos de los canales Kv y BK añadido a la solución de baño extracelular
Báscula de pesaje	Mettler Toledo	XS64
Microscopio invertido ZeissAxiovert 40C con objetivos de 10x y 40x	Carl-Zeiss	terminado	Parte de la configuración del equipo de anclaje de parche