Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
NOTA: Los ratones sanos de tipo salvaje (WT) (n = 4) y cd44-/- (n = 4) sin tratar fueron sacrificados a la edad de 12 a 16 semanas. Se utilizaron ratones machos y hembras. Todos los ratones estaban en el fondo C57Bl/6.
1. Disección de riñón de ratón
- Sacrificar ratones WT sanos o ratones genéticamente alterados por dislocación cervical.
- Disecciona riñones de ratón enteros directamente después de sacrificar a los ratones. Para ello, se realiza una laparotomía mediana con tijeras abdominales, cortando la piel y luego los músculos abdominales. Retira el intestino y colócalo junto al ratón.
- Libere los riñones del tejido conectivo y extraiga el riñón con pinzas quirúrgicas, cortando la arteria renal, la vena renal y el uréter con unas tijeras.
- Extraiga las cápsulas renales de los riñones sosteniendo el riñón con pinzas quirúrgicas y extraiga la cápsula con otro par de pinzas.
- Coloque los riñones en una placa de cultivo celular de 6 pocillos (2 riñones/pocillo) preparada con 2 mL de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) por pocillo y colóquelos en hielo.
2. Aislamiento de glomérulos de riñón de ratón
- Transfiera los riñones a una placa de Petri de 100 mm y pique los riñones en trozos pequeños de 1-2 mm con dos bisturíes. Mantenga húmedos los trozos de riñón picados con 1-2 mL de HBSS.
- Coloque los trozos de riñón picados encima de un tamiz metálico de 300 μm y presione el riñón a través del tamiz con un émbolo de una jeringa de 20 ml. Enjuague repetidamente el tamiz con HBSS en el medio y recoja el flujo en una placa de Petri limpia con una pipeta serológica. Recoja también todo lo que quede/se adhiera a la parte inferior del tamiz raspándolo con el bisturí y transfiéralo al flujo recogido (homogeneizado de riñón).
- Enjuague el homogeneizado de riñón a través de un tamiz de 75 μm con HBSS. Recoja el flujo y posteriormente enjuague este flujo a través de un tamiz de 53 μm. Lave ambos tamices con HBSS para eliminar todas las estructuras más pequeñas.
NOTA: En este paso, el flujo solo se enjuaga pero no se presiona a través del tamiz de 75 μm y 53 μm. El lavado con HBSS es necesario para eliminar los residuos y las estructuras más pequeñas de los tamices. Por lo tanto, normalmente se utilizan 200-300 mL de HBSS en total.
- Recoja las estructuras/material del riñón que quedan en el tamiz de 75 μm y 53 μm lavando la superficie superior de los tamices con el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 20% de suero fetal de ternero (FCS) y transfiera el material a una microplaca de fijación ultrabaja de 6 pocillos.
NOTA: Para lavar la superficie superior del tamiz, enjuague el tamiz en una posición inclinada (>45°) y recoja el material del riñón en el borde del tamiz. El material recolectado está enriquecido para glomérulos encapsulados y desencapsulados, mostrando solo unos pocos fragmentos tubulares. Los glomérulos encapsulados son muy pegajosos. Por lo tanto, para recolectar glomérulos individuales, es importante evitar que los glomérulos se adhieran a la superficie de una placa de Petri o una placa de pocillos. Para evitar la adherencia, utilice un medio con un 20% de FCS y utilice placas de fijación ultra bajas para este paso.
3. Cultivo de excrecencia glomerular
- Lleve la microplaca de fijación ultrabaja a un microscopio óptico invertido y recoja glomérulos individuales encapsulados y/o desencapsulados con una pipeta de 20 μL. Evite pipetear otras estructuras y desechos. Después de recoger un solo glomérulo en la punta de la pipeta, añada medio DMEM fresco sin material renal recogido en la misma punta de pipeta hasta un volumen de 20 μL.
- Transfiera el glomérulo individual con el medio DMEM de 20 μL al centro de un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incube durante 3 h a 37 °C y 5% (v/v) de CO2 para permitir la fijación del glomérulo al centro del pocillo. Mueva con cuidado la placa para evitar que el glomérulo flote hacia los bordes del pocillo.
- Después de 3 h de incubación, el glomérulo se adhiere al centro del pocillo. Agregue cuidadosamente 500 μL de medio basal endotelial (MBE) suplementado con un kit de factor de crecimiento que contenga hidrocortisona, factor de crecimiento endotelial humano, extracto de cerebro bovino y gentamicina sulfato-anfotericina B (Tabla de materiales) y 5% (v/v) de FBS y 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (pen/estreptococo) adicionales a cada pocillo.
- Cultivar los glomérulos individuales durante 6 días a 37 °C, 5% (v/v) de CO2.
NOTA: Dentro de 6 días, se forma el crecimiento externo que consiste en células epiteliales parietales. Si se pretende probar los efectos de compuestos o fármacos específicos en las células epiteliales parietales, se debe añadir al medio dentro de este período de 6 días.
