$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Implantar el tumor
NOTA: A cada ratón se le implanta 1 x 10 células 5 MB49-PSA en 50 μL de medio blanco DMEM en la vejiga. Debido al espacio muerto en el catéter, prepare siempre un volumen adicional (al menos 100 μL adicionales por ratón). Un enfoque alternativo sería usar una jeringa llena de aire.
- células
- Un día antes de la implantación, cuando las células están aproximadamente en un 80% confluentes, se hacen pasar las células tumorales MB49-PSA en medios DMEM completos (suplementados con 10% de FBS, 2 mmol/L de L-glutamina, 0,05 mg/mL de penicilina-estreptomicina y 200 μg/mL de higromicina B) a 37 °C y 5% de CO2 en una proporción de 1:2.
- El día del procedimiento, recoja las células raspándolas suavemente con un raspador de células estéril. Mezcle volúmenes iguales de la suspensión celular y una solución de azul de tripano al 0,4%. Cuente las células vivas con un hemocitómetro. No implante si más del 20% de las células están muertas.
- Calcule el número de células vivas necesarias (2 x 106 células/mL) y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en un medio en blanco DMEM. Repita el lavado tres veces para eliminar todos los rastros de FBS antes de la implantación.
- Mantenga la suspensión celular en hielo hasta que los ratones estén listos para la implantación.
- Permita que los ratones hembra C57BL/6J de 4 a 6 semanas de edad se aclimaten durante una semana antes del procedimiento. Todo el trabajo con animales debe realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener las condiciones estériles.
- Pesar a cada ratón e inyectar anestesia (75 mg/kg de ketamina y 1 mg/kg de medetomidina) por vía intraperitoneal a razón de 0,1 mL por 10 g de peso corporal. El peso corporal debe estar entre 17 y 22 g. Confirme la anestesia al observar que no hay respuesta después de un pinzamiento del dedo del pie.
- Para su identificación, marque la oreja con un punzón.
- Inyecte la solución de Hartmann o el compuesto de lactato de sodio por vía intraperitoneal a 0,1 ml por cada 10 g de peso corporal cada 1-2 h para hidratarse.
- Aplique ungüento oftálmico estéril en ambos ojos con una bombilla de algodón estéril, ya que el reflejo de parpadeo se pierde bajo anestesia y los ojos se resecan. Vuelva a aplicar cuando sea necesario.
- Coloque a los ratones en posición supina sobre toallas de papel encima de una bolsa de calor (activada por el contacto con el aire) para mantener la temperatura corporal y pegue las patas traseras con cinta adhesiva.
- Con un dedo, aplique una presión suave en la región abdominal inferior y recoja la orina de la vejiga en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta muestra sirve como valor basal del PSA urinario.
- Extraiga la poli-L-lisina estéril (PLL) en una jeringa de 1 ml y conecte un catéter intravenoso de calibre 24, sin el estilete de la aguja. Aplique lubricante en la punta del catéter e inserte el catéter a través de la uretra hasta la vejiga usando fórceps para guiar el cateterismo. Deténgase cuando se sienta resistencia.
NOTA: Los investigadores deben discutir con su personal veterinario sobre la necesidad del uso de un gel lubricante con anestésico para las instilaciones intravesicales y el uso de analgésicos posteriores al procedimiento.
- Instilar 50 μL de PLL lentamente, a razón de 10 μL cada 20 s, para evitar el reflujo vesicoureteral. Deje el catéter en la vejiga durante 20 minutos con un tapón para evitar el desbordamiento.
- Después de 20 minutos, retire el catéter y vacíe la vejiga de cualquier contenido presionando suavemente la región abdominal inferior. Con una jeringa vacía de 1 ml, enjuague el contenido restante del catéter.
- Mezcle bien las células MB49-PSA pipeteándolas y extráigalas en una jeringa de 1 mL. Coloque el catéter y aplique lubricante. Instilar 50 μL de 1 x 105 células a una velocidad lenta de 10 μL cada 20 s. Vuelva a colocar el tapón del catéter. Dé a los ratones de control 50 μL de solución salina.
- Después de 1 hora, retire los catéteres y vacíe la vejiga de cualquier contenido. Retire la cinta adhesiva de las patas traseras y coloque a los ratones sobre sus lados ventrales. Revivió a los ratones inyectando por vía subcutánea el fármaco de reversión (1 mg/kg de atipamezol) a 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
- Monitoree a los ratones hasta que se observe la motilidad. Regresa a los ratones a sus jaulas.