Entrega de plásmidos de ADN en urotelio de vejiga de ratón: un procedimiento basado en electroporación para administrar de manera eficiente plásmidos de ADN en células uroteliales de vejiga murina para generar modelos de ingeniería genética

Resumen

Fuente: Chuan, Y. et al. Método novedoso de entrega de ADN plasmídico al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación. J. Vis. Exp.(2018)

Este video demuestra la entrega de plásmido de ADN en el urotelio de la vejiga de ratón utilizando una combinación de técnicas de cateterismo uretral y electroporación. El procedimiento descrito permite la generación de modelos de cáncer de vejiga en ratones.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de plásmidos y herramientas

1. Para cada vejiga a transfectar, prepare al menos 20 μL de plásmido de ADN (1 μg/μL).
2. Agregue 1 μL de Azul de Tripán a los 20 μL de solución de plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetear para mezclar bien.
3. Esterilizar en autoclave todo el instrumental quirúrgico y esterilizar el espacio de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y los guantes con etanol al 70% con frecuencia o use un esterilizador de perlas de vidrio cuando realice los siguientes pasos para mantener las condiciones estériles.

>2. Entrega de plásmidos

1. Aplique etanol al 70% en el abdomen del ratón anestesiado y use un bisturí para hacer una incisión vertical de 1 cm para abrir la piel abdominal por encima de la vejiga.
2. Pipetear al menos 20 μL de plásmido más solución de azul de tripán en el extremo exterior del catéter y conectar la jeringa.
3. Inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa. Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la formación de burbujas de aire en la vejiga.
4. Agarre el orificio uretral externo con pinzas y luego retire el catéter y la jeringa. Use un hilo para apretar el orificio uretral externo. Haz dos bucles con la cuerda y luego átalos con dos nudos.
   nota: El endurecimiento de la uretra es importante para evitar el reflujo del líquido plásmido.
5. Encienda el generador de electroporación con los siguientes parámetros: 33 V, tiempo de trabajo de 50 ms y tiempo de intervalo de 950 ms.
6. Sostenga la vejiga con pinzas y apriete la vejiga con dos electrodos. Presione el pedal para realizar la electroporación.
   nota: Los pulsos eléctricos están configurados para ocurrir 5 veces con intervalos cortos después de cada pulsación del pedal. El ratón puede temblar en este proceso. Presionar el pedal más de una vez puede aumentar la eficiencia de la entrega, pero demasiados pulsos eléctricos pueden dañar la integridad tisular del urotelio.
   1. Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto generará una chispa.

>3. Recuperación

1. Sutura la abertura abdominal y cutánea con suturas quirúrgicas estériles y clips. Aplica yodo sobre la herida.
2. Retire al animal del sistema de isoflurano. Administrar buprenorfina, analgésico (0,1 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor postquirúrgico.
3. Mantenga al animal en la almohadilla térmica y devuélvalo a la jaula de origen después de la recuperación completa. Revise al animal al menos una vez al día para ver si tiene comportamientos normales de movilidad, bebida y alimentación, y si no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado, y luego retire las pinzas. Administre inyecciones posteriores de analgésico de buprenorfina si el animal muestra síntomas de dolor, como disminución del acicalamiento, aumento de la agresividad y la vocalización.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa BD de 1 ml de TB	pescador	148232E
Buprenorfina	sigma	B9275-50MG
Pinzas Dumont	Roboz Instr Quirúrgico	RS-5005	Tratar con etanol al 70% antes del uso quirúrgico
Electroporador de onda ECM830 SQ	Aparato de Harvard	450052
Catéteres intravenosos desechables Safelet de Exel International	Fisher Científico	Teléfono 14-841-21	24G, 2,11 cm de longitud, 0,045 cm de diámetro exterior
Tijeras de microdisección extrafinas	Roboz Instr Quirúrgico	RS-5135	Tratar con etanol al 70% antes del uso quirúrgico
Isoflurano	Veterinario uno	501017
Colchoneta de descanso calefactada K&H para animales pequeños, de 9 por 12 pulgadas	amazona		Cubra la alfombrilla térmica con toallas de papel
Pomada oftálmica	pescador	NC0849514
PBS, pH 7.4	Tecnologías de la Vida	10010049
Puntas de pipeta 200 μL	Científico de EE. UU	1111-0206
Puntas de pipeta, ajuste universal; 0,1 a 10 μL	pescador	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plásmido CAG-GFP	Addgene	Año 16664
Pinza de platino 5 mm	Aparato de Harvard	450489	5 mm de diámetro
tijeras	Roboz Instr Quirúrgico	RS-5880	Tratar con etanol al 70% antes del uso quirúrgico
Cuerda de cuerda	amazona		Mandala Crafts 150D 210D 0.8 mm 1 mm costura de cuero costura hilo encerado plano cordón de cuerda
Cinta, Scotch	pescador	19047257
Therio-gel Lubricante Veterinario	PBS sanidad animal	353-736
Mancha azul de tripán	Tecnologías de la Vida	15250061
V-1 Sistema de anestesia de sobremesa	VetEquip	901806
Sutura violeta Vicryl 18" FS-2 corte 5-0	pescador	NC0578475
Walgreens Povidona Yodada 10%	Walgreens (en inglés)	953982
Pinza para heridas	pescador	Año 18045
Aplicador de clip para heridas	pescador	Año 1804

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