Aislamiento de exosomas: una técnica de ultracentrifugación basada en la densidad que utiliza un cojín de sacarosa para separar exosomas de medios acondicionados de células cultivadas

Resumen

Fuente: Faruqu, F. N. et al. Preparación de exosomas para la entrega de siRNA a células cancerosas.J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe una técnica de ultracentrifugación basada en la densidad para aislar exosomas de medios acondicionados recolectados de cultivos de células de riñón embrionario humano utilizando un cojín de sacarosa al 25% (p/p) preparado en óxido de deuterio. Los exosomas aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Aislamiento de exosomas en una almohadilla de sacarosa

1. Limpie previamente el medio acondicionado cosechado (CM) mediante centrifugación diferencial y filtración de la siguiente manera.
   1. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y deseche el pellet. Repita este paso de centrifugación una vez más, recuperando el sobrenadante y desechando el pellet.
   2. Centrifugar el sobrenadante del paso 1.1. a 2.000 x g durante 15 min y 4 °C y luego desechar el pellet. Filtre el sobrenadante recuperado una vez a través de filtros de 0,22 μm.
2. Durante la limpieza previa, prepare una solución de sacarosa al 25% (p/p) en óxido de deuterio pesando con precisión 1,9 g (± 0,001 g) de sacarosa en un tubo universal y luego rellenando con óxido de deuterio hasta que el peso alcance los 7,6 g (± 0,001 g).
3. Llene un tubo de ultracentrífuga (consulte la Tabla de materiales) con 22,5 mL de CM previamente aclarado. Compone el MC hasta 22,5 mL con PBS filtrado de 0,22 μm si el volumen actual es menor que eso.
4. Coloque una pipeta de vidrio (consulte la tabla de materiales) en el tubo y, a través de ella, agregue 3 ml de solución de sacarosa para que la solución forme una capa separada debajo del CM.
5. Coloque con cuidado el tubo que contiene la solución de CM/sacarosa en capas en el cubo de un rotor oscilante (consulte la Tabla de materiales) y asegure el cubo en el rotor.
6. Coloque el rotor en la ultracentrífuga (consulte la tabla de materiales) y gire a 100.000 x g durante 1,5 h a 4 °C.
7. Recoja 2 mL de la capa de sacarosa y agréguela a una botella de ultracentrífuga (consulte la Tabla de materiales) que contenga 20 mL de PBS filtrado para un paso de lavado.
8. Coloque los tubos en un rotor de ángulo fijo (consulte la tabla de materiales) y gire a 100.000 x g durante 1,5 h a 4 °C.
9. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL y vuelva a suspender el pellet con PBS filtrado de 400 μL. Mantenga este stock de exosomas a 4 °C o -80 °C para el almacenamiento a corto y largo plazo, respectivamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
sacarosa	Fisher Científico	S/8600/60	1 kg
Óxido de deuterio (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 g
1X solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher Scientific	10010015	500 ml
Unidad de filtro de jeringa Millex-GP de 0,22 μm	Millipore	SLGP033RS
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Rotor basculante	Beckman Coulter	SW45 Ti
Rotor de ángulo fijo	Beckman Coulter	Tipo 70 Ti
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	355631	Policarbonato. Llenado máx. 32 ml
Botellas ultracentrífugas	Beckman Coulter	355618	Policarbonato. Llenado mín. 16 ml, llenado máx. 25 ml
centrífuga	Eppendorf	5810R
Pipetas de vidrio	Fisher Científico	Números de 1156 a 6963
25% p/p cojín de sacarosa			Añade 1,9 g (± 0,001 g) de sacarosa en un tubo universal y rellena con D2O hasta que el peso alcance los 7,6 g (± 0,001 g). Esto hace ~ 6 ml del cojín de sacarosa del 25% p/p.