Encapsulación de siRNA en exosomas mediante electroporación: una técnica basada en pulsos eléctricos para cargar siRNA en exosomas

Resumen

Fuente: Faruqu, F. N. et al. Preparación de exosomas para la entrega de siRNA a las células cancerosas. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe un método basado en electroporación para encapsular siRNA en exosomas. Los exosomas cargados de siRNA pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas.

Protocolo

>1. Encapsulación de siRNA en exosomas por electroporación

1. Enfríe previamente la cubeta de electroporación (consulte la tabla de materiales) en hielo durante 30 minutos antes de la electroporación.
2. Mezclar 7,0 μg de exosomas (32 μL de 7 x 10¹² p/mL de stock en PBS) con 0,33 μg de siRNA (12 μL de 2 μM de stock en agua libre de RNasa) en el tubo de microcentrífuga. Aumente el volumen hasta 150 μL con tampón de ácido cítrico (consulte la tabla de materiales). La relación molar entre el exosoma y el siRNA es de 1:60 en este caso.
3. Transfiera la mezcla a la cubeta de electroporación. Tape la cubeta y colóquela en el soporte de la cubeta del electroporador (consulte la Tabla de materiales). Gire la rueda giratoria 180° en el sentido de las agujas del reloj.
   nota: La rueda debe girarse completamente a la posición de bloqueo, para que la cubeta entre en contacto con los electrodos.
4. Seleccione el programa de electroporación deseado (por ejemplo, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) e inicie la electroporación pulsando el botón >nota: Un pulso exitoso se indica mostrando "OK" en la pantalla.
5. Una vez electroporado, retire la cubeta después de girar la rueda 180° en sentido contrario a las agujas del reloj. Extraiga la muestra de la cubeta con la pipeta de plástico para su posterior procesamiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(Etiquetado-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (Sin etiquetar) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Pipetas de vidrio	Fisher Científico	Números de 1156 a 6963
Amaxa Nucleofector I	Lonza	Nucleofector I	Con los kits Nucleofector de Amaxa
Tampón de ácido cítrico con EDTA			Mezclar 0,1954 g de ácido cítrico y 0,2087 g de fosfato disódico en 50 mL de agua desionizada. Agregue EDTA a 0.1 mM. Ajusta el pH a 4,4.
Tubos de microfuga	Laboratorio estelar	S1615-5500	1,5 ml