$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Procesamiento de tejidos y aislamiento de células tubulares primarias
- Retirar las cápsulas renales y la médula, picar ambos riñones en trozos pequeños e incubarlos en 10 ml de tampón de digestión en un horno a 37 °C con rotación suave durante 5 min.
- Elimine los tejidos renales no digeridos pasando el tampón a través de un filtro de 70 μm. Añadir 10 mL de medio de cultivo para detener la digestión.
- Para recolectar celdas tubulares, centrifugar la suspensión de celda filtrada a 50 x g durante 5 min para recolectar el primer pellet. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y agregue 5 mL de medio de cultivo, centrifugue a 50 x g durante 5 min para asegurarse de que todas las células tubulares se recojan en el segundo pellet. La centrifugación se realiza a una velocidad más baja para pellets principalmente en túbulos pesados. Posteriormente, una vez que las células se recuperan del aislamiento, el cultivo tubular puro se centrifuga a mayor velocidad durante los subcultivos.
- Vuelva a suspender el primer pellet en 20 mL de medio de cultivo y centrifugue a 50 x g durante 5 min para recoger el tercer pellet.
- Vuelva a suspender el segundo y tercer pellet en 1 mL de medio de cultivo. Mezcle 10 μL de la suspensión de celdas con 10 μL de azul de tripano, cargue la mezcla en la cámara A de un portaobjetos de conteo y registre la viabilidad de la celda desde el contador automático de celdas.
- Siembre hasta 107 células (una población heterogénea) en una sola placa de 60 mm pre-recubierta con colágeno y deje que las células tubulares se adhieran durante la noche.