Tinción de ácido peryódico Schiff o PAS: un método para evaluar las deformidades estructurales del glomérulo

Resumen

Fuente: Stevens, M., Oltean, S. Evaluación de la función renal en modelos de ratón de enfermedad glomerular.J. Vis. Exp. (2018)

En este video, describimos el protocolo para realizar la tinción de Schiff de ácido peryódico (PAS) para evaluar las anomalías estructurales en el glomérulo renal. El método de tinción PAS permite una evaluación adecuada de la fisiopatología del glomérulo.

Protocolo

1. Tinción de Schiff de ácido peryódico (PAS)

NOTA: La tinción PAS resaltará las membranas basales de los asas capilares glomerulares y el epitelio tubular. Permite una visualización detallada de las células glomerulares, la matriz mesangial y la posible expansión, y los posibles cambios de la GBM (es decir, engrosamiento e irregularidades).

1. Seccione la corteza renal fijada en PFA incrustada en parafina utilizando un micrótomo de 5 μm de espesor en portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Secar a 37 °C durante 1 h. Asegúrese de que la sección no contenga pliegues o agujeros que puedan distorsionar la morfología bajo el microscopio.
2. Desparafinar los portaobjetos incubándolos dos veces en xileno (PRECAUCIÓN, irritante; úselo en la cámara de gases) durante 3 minutos cada uno, dos veces en EtOH al 100% durante 3 minutos cada uno, y luego una vez en EtOH al 95%, 70% y 50% durante 3 minutos cada uno, todos a temperatura ambiente. Rehidratar los portaobjetos en dH₂O.
3. Incubar los portaobjetos en una solución de ácido peryódico (PRECAUCIÓN, irritante; uso en la cámara de gases) (1 g/dL) durante 5 min, y luego enjuagar los portaobjetos en varios cambios de dH₂O. Utilice un recipiente con 100 mL dH₂O a temperatura ambiente.
4. Incubar portaobjetos en el reactivo de Schiff (Parasoanilina HCl 6 g/L y metabisulfito de sodio 4% en HCl 0,25 mol/L) durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 minutos.
5. Contratinción con hematoxilina durante 3 s antes de enjuagar a fondo los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 15 min.
   nota: Es posible que se requiera cierta optimización para determinar el momento óptimo para la tinción con hematoxilina.
6. Deshidrate los portaobjetos utilizando el reverso del protocolo de desparafina. Termina con xileno.
7. Seque al aire las correderas y el montaje con medios de montaje a base de xileno.
8. Imagen en un microscopio óptico con un aumento de 400X para evaluar las estructuras glomerulares. Evalúe lo siguiente: engrosamiento e irregularidades del GBM, colapso de asas capilares, tejido fibrótico, esclerosis, proliferación celular (células endoteliales, podocitos y mesangiales o inflamatorias que infiltran el penacho).
   nota: Para una evaluación completa de la fisiopatología glomerular, se deben evaluar las lesiones en otras partes del riñón, como en los túbulos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS)	Sigma-Aldrich	395B-1KT
hematoxilina	Sigma-Aldrich	H3136
xileno	MerckMillipore	108298
Portaobjetos de preparación de polietileno	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Medio de montaje	ThermoFisher Scientific	8030
Bolígrafo hidrofóbico	Abcam	AB2601
Miscroscopio de luz fluorescente	Microsistemas Leica
Software de análisis de imágenes J	Imagen J