Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Realizar la Cirugía Hidrodinámica de Inyección de Pelvis Renal
- Seleccione cuidadosamente los ratones para la cirugía.
NOTA: Todavía no se han observado diferencias específicas de la cepa, pero pueden ser posibles. La mayoría de las inyecciones se han realizado en los fondos C57BL/6 o FVB. Las inyecciones de pelvis renal funcionan mejor en ratones de 6 a 12 semanas de edad. En ratones de más de 16 semanas, es posible una tasa de fracaso de hasta el 50% por imágenes de luciferasa por razones poco claras. La misma tasa de fracaso relacionada con la edad se ha observado para las inyecciones hidrodinámicas de la vena de cola en el hígado, por lo que esto puede ser una limitación general relacionada con el principio de la inyección hidrodinámica. En la misma línea, otros han demostrado que la inyección hidrodinámica de la vena de la cola en el hígado fibrótico de rata no es tan efectiva como el hígado sano, por lo que puede ser posible que en entornos de fibrosis renal la inyección hidrodinámica de la pelvis renal no sea tan efectiva, pero esto no se ha probado directamente.
>2. Preparar ratones y jeringas de ADN para la cirugía
- Anestesiar a los ratones con ketamina y xilacina.
- Póngase el equipo de protección personal correcto requerido por el animalario, como un delantal de laboratorio desechable, una mascarilla quirúrgica y guantes de nitrilo.
- Trabajando con 2 a 4 ratones a la vez, pese cada ratón en un vaso de plástico de 500 ml en una báscula con una precisión de 0,1 g. Calcule la cantidad correcta de 24 mg/ml de ketamina y 2 mg/ml de xilacina diluidos en solución salina normal al 0,9% para administrar a cada ratón mediante inyección intraperitoneal (consulte el video de referencia para obtener más información sobre la inyección intraperitoneal). Utilice la fórmula (50 μL + ((5 μL) x (peso (g))), o alternativamente calcule de acuerdo con otra fórmula después de consultar con el equipo veterinario local y la IACUC.
- Inyectar el ratón por inyección intraperitoneal mediante técnicas estándar. Coloque el ratón en un cubo de papel hasta que el ratón quede inmóvil.
NOTA: Los ratones están listos para la cirugía cuando ya no responden a la prueba de pellizco de los dedos de los pies. Dé a los ratones que continúan respondiendo a la prueba de pellizco de los dedos del pie de 20 a 30 minutos después de la inyección inicial de 20 a 60 μL más anestésico, dependiendo de la fuerza de la respuesta.
- Coloque el ratón en una almohadilla térmica con circulación de agua cubierta con una almohadilla azul y coloque ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la desecación de la córnea.
- Afeita el lado izquierdo de la espalda del ratón desde el hombro hasta la grupa y desde el flanco hasta la columna vertebral con una afeitadora diseñada para el aseo de mascotas. Retira el pelo suelto y los residuos.
- Prepare una jeringa separada que contenga 100 μL de ADN diluido para cada ratón anestesiado, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
- Utilice una jeringa de insulina estéril U-100 de 29G x 1/2" 0.5 mL con una aguja fija permanentemente sin un seguro.
NOTA: El tipo de jeringa es de vital importancia. Este manómetro permite una inyección rápida. La aguja fija permanentemente evita que la solución se escape. La presencia de seguridad impedirá el acceso a la pelvis renal. Las jeringas especificadas en la Tabla de Materiales se deslizan de manera más uniforme durante la inyección que otras marcas probadas.
- Cargue la jeringa a ~120 μL y tire del émbolo hacia abajo para crear un espacio en la parte superior. Golpee con un bolígrafo hasta que todas las burbujas de aire suban a la parte superior. Sosteniendo la aguja hacia arriba, presione con cuidado el émbolo para eliminar todo el aire hasta que se forme una gota en la punta de la aguja. No debe haber burbujas visibles, ya que pueden causar una embolia gaseosa que matará al animal.
- Termine de presionar el émbolo hasta que haya 100 μL en la jeringa vaciando el exceso de solución de ADN en el tubo de microfuga original. Etiquete cuidadosamente si es necesario y coloque las jeringas cargadas sobre un paño estéril para mantener la esterilidad si la instalación donde se está trabajando no permite volver a tapar las agujas.
>3. Realizar cirugía de inyección
- Prepare el sitio para la cirugía. Coloque un paño estéril sobre la almohadilla térmica y vacíe las herramientas quirúrgicas estériles sobre el paño estéril sin tocarlas. Levanta el ratón y colócalo en el campo de visión. Ajuste la iluminación para iluminar el área.
- Retire tres hisopos antisépticos cutáneos con gluconato de clorhexidina al 3,15% y alcohol isopropílico al 70% de los paquetes y colóquelos cerca del animal.
- Cámbiese a guantes quirúrgicos estériles. Trabajando con un movimiento circular comenzando en el sitio de la incisión, frote al animal con un nuevo hisopo de clorhexidina/alcohol tres veces.
- Ubique el sitio de la incisión como se muestra en la Figura 1A. Pellizcando la piel con pinzas, use tijeras para hacer un corte en la capa de la piel aproximadamente a 1 cm de la columna vertebral y debajo de la caja torácica. Una vez que el sitio de corte tenga aproximadamente 1 cm de largo, haga un sitio de corte similar debajo, en la capa muscular.
NOTA: Haga la incisión de la longitud correcta para permitir que el riñón apenas pase por la incisión y luego se mantenga en su lugar por la incisión misma. Una incisión demasiado pequeña y el riñón no puede quedar expuesto; Si es demasiado grande, el riñón se deslizará continuamente hacia la cavidad abdominal.
- Localice el riñón.
nota: Puede ser visible entre el tejido adiposo blanco. El bazo también se encuentra en el lado izquierdo del animal. El color de estos órganos se puede diferenciar visualmente, ya que el bazo es de color marrón oscuro, mientras que el riñón es de color rojo anaranjado oscuro. No es deseable manipular el bazo, ya que puede romperse fácilmente.
- Sin tocar el riñón, expóngalo suavemente de la cavidad abdominal ejerciendo una presión constante y suave sobre el abdomen con los dedos (Figura 2C). Use pinzas cerradas para empujar suavemente los órganos no deseados hacia el abdomen si es necesario. No use fórceps abiertos, ya que esto puede dañar el riñón u otros órganos.
- Una vez que el riñón esté fuera del abdomen, sepárelo suavemente de la grasa circundante lo suficiente para visualizar la pelvis renal, un pequeño punto blanco (Figura 1B). Empuje el exceso de grasa hacia un lado o retírela si es necesario. Asegúrese de no extirpar la glándula suprarrenal, ubicada cerca del polo superior del riñón, ni la cápsula renal.
- Usando pinzas cerradas para empujar hacia abajo el lado derecho del riñón de modo que la pelvis renal permanezca a la vista, agarre la jeringa de insulina cargada con la mano derecha y manténgala paralela a la superficie de trabajo con la aguja apuntando a la pelvis renal (Figura 2E). Inserte la aguja con cuidado en la pelvis renal del riñón inmovilizado como se muestra en la figura 1B.
- Inyecte la solución rápidamente en tres segundos. Alrededor de un tercio del riñón puede aclararse y cambiar de color a blanco.
NOTA: Es común observar la acumulación de líquido en la cápsula renal después de la inyección, así como la formación de un hematoma. Es necesario algún daño para lograr un nivel suficiente de transfección de ADN para la detección.
- Mantenga la aguja en su lugar durante aproximadamente 10 s para evitar el reflujo de la solución. A continuación, retire la aguja con cuidado y lentamente. Regrese el órgano a la cavidad abdominal estirando suavemente el sitio de la incisión y usando pinzas cerradas.
- Suturar la capa muscular del animal con suturas reabsorbibles 5-0, colocando 2-4 nudos independientes.
- Suturar la capa de piel del animal con suturas de nylon no absorbible 5-0 o 6-0, colocando 2-4 nudos independientes.
NOTA: Los instrumentos quirúrgicos se pueden reutilizar después de colocarlos en un baño de perlas estériles y enfriarlos.
