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1. Implantación de células
Para implantar células Renca por vía intrarrenal, prepare las células Renca en una suspensión unicelular a 2 x 106 células/mL en la Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
- Eliminar las células Renca adheridas del matraz de cultivo de tejidos utilizando tripsina al 0,25% en HBSS. Después de ~ 5 minutos, agregue RPMI completo al matraz para neutralizar la tripsina y transfiera las celdas a un tubo de centrífuga para el lavado. Centrifugar las celdas a una fuerza centrífuga relativa de 300 g (rcf x g) durante 5 min a 25 °C.
- Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en HBSS. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste el volumen con HBSS para producir 2 x 106 células/mL.
- Extraiga las células en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 18 para evitar el esfuerzo cortante en las células. Reemplace la aguja de calibre 18 por una aguja de calibre 28 antes de la inyección de las células tumorales. Una inyección de 0,1 mL introduce 2 x 105 células en el riñón.
>2. Preparación del área quirúrgica
- Prepare un área quirúrgica estéril en un gabinete de bioseguridad colocando un paño quirúrgico estéril sobre una almohadilla térmica. Reúna todos los suministros, incluidos fórceps, bisturí, tijeras, gotas para los ojos, antiséptico de povidona yodada al 5% y gasas estériles. Autoclave todos los instrumentos antes de su uso.
- Realizar la cirugía utilizando una técnica de punta aséptica. Reesterilizar los instrumentos entre animales con un esterilizador de perlas. Use guantes estériles, una bata de laboratorio y una mascarilla.
>3. Preparación de los animales
- Anestesiar a los ratones con ketamina/xilacina (87,5 mg/kg y 12,5 mg/kg, respectivamente, i.p.) de acuerdo con las directrices institucionales. Determine la profundidad del anestésico realizando un pellizco en el dedo del pie.
- Cuando se considere que el animal no responde, prepare el lugar de inyección (por ejemplo, el flanco izquierdo) en los ratones Balb/c arrancando (con los dedos) o afeitando (con tijeras) el pelaje.
- Mueva los ratones del área de preparación para la cirugía (por ejemplo, la jaula de alojamiento) al área quirúrgica y aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Frote generosamente el sitio de la incisión preparado con un antiséptico de povidona yodada al 5%.
- Inyecte clorhidrato de bupivacaína (0,1 mL de una solución de 2,5 mg/mL, s.c.) en el área donde se realizará la incisión como analgesia preoperatoria.
- Realice una sola incisión (~1,0 a 1,5 cm) en el flanco izquierdo del animal con un bisturí estéril o unas tijeras con cuidado para no penetrar en el peritoneo. Separe la dermis del peritoneo con unas tijeras estériles. Frote el sitio de la incisión con una gasa de algodón estéril para eliminar la sangre.
- Sostenga el mouse con ambas manos, usando la mano izquierda para sostener la cabeza y la mano derecha para sostener el flanco.
- Identifique el bazo a través del peritoneo y, con un dedo de la mano derecha, palpe al ratón desde abajo; el riñón ahora debería ser visible a través del peritoneo. Sujete firmemente al animal para proporcionar tensión a través del peritoneo y el riñón.
- Pida a una segunda persona que inyecte las células tumorales (preparadas en la sección 1.2) a través del peritoneo intacto hasta el centro del riñón utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 28. Administre lentamente 0,1 ml (2 x 105) de células. Una vez que se inyectan las células, mantenga la aguja en su lugar durante 5 a 10 segundos para reducir el reflujo de las células. Es importante tener en cuenta la necesidad de extremar la precaución durante este paso, ya que la persona que inyecta las células acercará la aguja a los dedos de la persona que sostiene el ratón.
- Retire la aguja y cierre la incisión con una fina capa de adhesivo tisular de cianoacrilato.
- Vuelva a colocar al animal en una jaula limpia con una toalla de papel estéril. Permita que los animales se recuperen en una almohadilla térmica. No deje a los animales desatendidos durante el período de recuperación. No devuelva a los animales a las condiciones normales de alojamiento hasta que estén erguidos y esternales. Seguir las directrices institucionales en todos los procedimientos con animales de laboratorio.