Análisis de expresión de proteínas basado en matrices de proteínas de fase inversa: un procedimiento para la cuantificación simultánea de la expresión de múltiples proteínas a partir de lisado celular

Abstract

Fuente: O'Mahony, F. C. et al. El uso de matrices de proteínas de fase inversa (RPPA) para explorar la variación de la expresión de proteínas dentro de los cánceres individuales de células renales. J. Vis. Exp. (2013)

Este video demuestra la metodología para realizar Matrices de Proteínas de Fase Inversa (RPPA) para estudiar los patrones de expresión de proteínas a partir de lisado celular. En RPPA, el lisado que contiene una mezcla de proteínas se imprime en portaobjetos de nitrocelulosa y las proteínas de interés se analizan utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia.

Protocol

1. Impresión RPPA

1. Los lisados de proteínas se detectaron en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa (Fastslides-Whatman) utilizando un observador robótico MicroGrid II. Los portaobjetos utilizados contenían 2 almohadillas en las que se localizaron las muestras. Cada almohadilla fue detectada con muestras idénticas, en este caso, 100 muestras. Otros formatos disponibles incluyen diapositivas de 1, 8 y 16 almohadillas. Cuanto mayor sea el número de almohadillas, menor será el número de muestras que se pueden ver en cada una.
2. Se hizo una serie de cinco diluciones de 2 veces a partir de cada muestra y luego se detectó por triplicado (lo que resultó en un total de 15 manchas por muestra).

>2. Detección de proteínas RPPA

1. Deslizamientos húmedos en exceso de tampón de bloqueo LiCor (diluido 50:50 en PBS). Incuba en RT durante 1 hora en una plataforma mecedora.
2. Prepare 800 μL de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo LiCor (diluido 50:50 en PBS) a las concentraciones deseadas y manténgalo en hielo.
3. Monte los portaobjetos en (i) el clip de chip de un solo bastidor o (ii) el soporte de portaobjetos de cuatro bahías 'FastFrame' para que se forme un sello hermético entre el portaobjetos y la cámara de incubación.
4. Retire el tampón residual de los pocillos y agregue 600 μL de anticuerpo primario a los pocillos respectivos.
5. Coloque el portaobjetos y la cámara en una caja húmeda sellada e incube en una plataforma oscilante durante la noche a 4 °C.
6. Constituye un 0,1% de PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL de PBS).
7. Retire los portaobjetos de la cámara frigorífica y retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada pocillo.
8. Añadir 600 μL de PBS-T y lavar los portaobjetos en la plataforma mecedora a RT durante 5 min (X3).
9. Prepare anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia diluyendo en Tampón bloqueador Odyssey (diluido 50:50 en PBS) SDS al 0,01% en dilución 1:2.000 (1 μL/2 mL) en primera instancia.
10. Retire el tampón de los pocillos y agregue 600 μL de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a los pocillos respectivos. Incubar los anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 minutos agitando suavemente; Es importante proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se haya escaneado.
11. Retire los anticuerpos secundarios del pocillo y lave brevemente (x3) en 600 μL de PBS-T a temperatura ambiente. Retire el portaobjetos del soporte, transfiéralo a un recipiente adecuado y lave con el exceso de PBS-T durante 15 minutos, manteniendo la membrana a oscuras.
12. Retire el PBS-T y siga lavando la membrana con PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar los residuos de Tween-20, manteniendo nuevamente la membrana en la oscuridad.
13. Seque el Fastslide en un horno a 50 °C durante 10 minutos y luego escanee en el escáner Li-Cor Odyssey. Mantenga la diapositiva en la oscuridad hasta que haya sido escaneada.
14. Escanee el portaobjetos a 680 nm y/o 800 nm dependiendo del anticuerpo o anticuerpos secundarios utilizados. Para la detección de dos colores, utilice siempre anticuerpos secundarios con alta adsorción cruzada para minimizar la reactividad cruzada. Es necesaria una selección cuidadosa de los anticuerpos primarios y secundarios para la detección de dos colores. De importancia primordial es la selección de diferentes especies huésped (por ejemplo, conejo y ratón) para los dos anticuerpos primarios. Esto permite la discriminación por anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón que están marcados con colorante con espectros de emisión fácilmente distinguibles.
15. Los archivos de imagen se guardan como archivos .tiff. La Figura 1 muestra la imagen de los archivos escaneados.

Results

Figura 1: Diagrama de flujo del proceso de escaneo RPPA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tritón X-100	Tritón-X	T8787
Búfer de bloqueo Li-Cor Odyssey	Li-Cor	927-40000
Observador robótico MicroGrid II	Biorobótica
Soporte de corredera de cuatro bahías FastFrame	Whatman	10486001
Corredera FAST - 2 almohadillas	Whatman	10485317
IRDye 680LT Cabra anti-Ratón IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW Cabra anti-Conejo IgG	Licor	926-32211