Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de soluciones
- Prepare una solución madre 50x de medios de embriones E3 mezclando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 y 9,95 g de MgSO4 en 5 L de agua destilada, y almacene en RT.
- Prepare una solución madre 50x de medios de embriones E3 mezclando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 y 9,95 g de MgSO4 en 5 L de agua destilada, y almacene en RT.
- Para el cultivo de embriones de pez cebra, diluya la solución madre 50x de material de embrión E3 en una solución de trabajo 1x con agua destilada, luego agregue 200 μl de azul de metileno al 0,05% por cada 1 L de 1x E3 para que actúe como fungicida, y almacene en RT.
- Prepare una solución bloqueadora de pigmentación de medios embrionarios E3 con 1-fenil-2-tiourea (PTU) al 0,003% combinando 40 ml del caldo 50x E3 con 0,06 mg de PTU. A continuación, aumente el volumen a un total de 2 L con agua destilada.
- Agite el E3/PTU O/N en RT para que el polvo de PTU se disuelva con él. A continuación, almacene el E3/PTU en RT.
nota: El E3/PTU tiene una vida útil de aproximadamente una semana, y las soluciones más antiguas serán menos efectivas para bloquear el desarrollo de la pigmentación en las larvas de pez cebra.
- Prepare una solución anestésica de Tricaína al 0,2% (MS-222) añadiendo 1 g de Tricaína a 500 mL de agua destilada y ajuste el pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5.
>2. Preparación de herramientas
- Prepare una herramienta manipuladora de embriones, utilizada para posicionar embriones para la microinyección, colocando una punta de carga de gel en el extremo de una aguja de disección recta de 5 pulgadas, y asegúrela con cinta adhesiva o superpegamento.
- Prepare las agujas de microinyección con un extractor de agujas, colocando primero un vidrio de borosilicato de 10 cm pulido al fuego con filamento en el instrumento y asegure el vidrio de borosilicato apretando los mangos.
- Tire del vidrio de borosilicato para formar agujas finamente cónicas. Utilice los siguientes ajustes: calor 540, tirón 245, velocidad 200 y tiempo 125.
- Coloque las agujas dentro de una placa de Petri, suspendiéndolas en una tira de arcilla para modelar para proteger las puntas de las agujas, y mantenga la placa cubierta para evitar la acumulación de polvo.
- Para terminar de preparar la aguja para las microinyecciones, use una hoja de afeitar o un filo de pinza fino para cortar el extremo tirado de la aguja y crear una punta de inyección angular afilada con un diámetro de aproximadamente 0,05 a 0,1 mm.
- Para hacer la bandeja de microinyección, prepare una solución de agarosa al 1,5%/E3 en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y disuelva la agarosa calentando el E3 hasta hervir en un microondas y luego deje enfriar a RT durante aproximadamente 10 min.
- Vierta la solución de agarosa/E3 enfriada en una placa de Petri para hacer una base con una profundidad de aproximadamente 0,5 cm. Cuando esto se haya solidificado, vierta una segunda capa con una profundidad de aproximadamente 0,3 cm e inserte el molde prefabricado del pozo embrionario y deje que la agarosa se solidifique a RT.
nota: Al insertar el molde en la capa superior de agar / E3, coloque el molde en el agar en ángulo para disminuir la cantidad de burbujas de aire.
- Cuando toda la bandeja de microinyección se haya endurecido, levante el molde del pozo embrionario prefabricado y extiéndalo lentamente y con cuidado con una cuchara, luego llene el plato con solución E3 y guárdelo a 4 °C.
>3. Microinyección de solución de nefrotoxina
- El día de la inyección, prepare la solución de nefrotoxina deseada junto con el control del vehículo adecuado.
- Agite suavemente para asegurarse de que el medicamento esté en solución, revisando los lados del tubo y la parte superior de la columna de agua><.
nota: Las soluciones de nefrotoxina se pueden preparar para contener trazas de dextrano conjugado con fluorescencia para monitorear la eficiencia de la microinyección y también evaluar el aclaramiento renal en puntos de tiempo posteriores.
- Cargue una aguja de microinyección recortada con ~ 2-3 μL de nefrotoxina enhebrando una punta de carga de gel fino en la parte posterior de la aguja y suspenda la aguja verticalmente con un trozo de cinta adhesiva para permitir que la solución llene la punta de la aguja recortada por gravedad.
- Una vez que la punta de la aguja esté llena, asegure la aguja cargada en el micromanipulador.
- Pruebe el volumen de microinyección colocando una gota de aceite mineral en un portaobjetos micrométrico e inyecte en el aceite para evaluar el tamaño de la gota. Un volumen de inyección de 500 pl tiene un diámetro de 0,1 mm.
- Retire la placa de embriones de la incubadora y anestesia agregando aproximadamente 5 mL de tricaína al 0.2% a la placa de embriones.
- Para asegurar una anestesia completa, toque suavemente el embrión con la punta de la herramienta manipuladora de embriones. La falta de movimiento indica una anestesia suficiente.
- Después de una anestesia exitosa, transfiera los embriones al molde de inyección con una pipeta de transferencia.
- Maniobra cada embrión en un pocillo diferente del molde, colocando la cabeza en el área más profunda del pocillo, de modo que el tronco descanse a lo largo de la depresión y la cola sobresalga de la depresión.
- Inserte la aguja llena en el micromanipulador y coloque la punta de la aguja junto a un embrión.
- Inserte suavemente la aguja en el vaso de cola moviendo el joystick hacia adelante y pise el pedal para administrar la microinyección.
nota: El éxito de la inyección se puede medir observando cómo el líquido entra en circulación. Además, la coinyección del nefrotóxico con dextrano conjugado con fluorescencia permite al investigador verificar el éxito de la inyección después del procedimiento.
- Tire suavemente hacia atrás del joystick para extraer la aguja del embrión.
- Después de la inyección, transfiera los embriones a un plato limpio y enjuague para eliminar la tricaína y reemplácela con E3 / PTU fresca.
- Incubar el embrión hasta el punto de tiempo deseado para evaluar la morfología, que puede documentarse mediante fotografía en medios de montaje de metilcelulosa, o procesar para el análisis experimental según se desee.
nota: La recuperación de los embriones debe evaluarse para determinar el porcentaje de individuos con edema, que comúnmente indica lesión renal.
