Preparación de un riñón de montaje plano: un procedimiento para diseccionar y preparar un montaje plano para el análisis microscópico del riñón de pez cebra adulto

Resumen

Fuente: McCampbell, K. K. et al. Análisis de la composición y función de las nefronas en el riñón adulto del pez cebra.J. Vis. Exp. (2014)

Este video muestra la disección y preparación de una montura plana del riñón del pez cebra adulto. La montura plana preparada se puede visualizar bajo el microscopio para el análisis de muestras.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Disección y Preparación de Montaje Plano del Riñón de Pez Cebra Adulto a partir de una Muestra de Animal No Fijada para Visualizar el Marcaje de Dextrano Fluorescente del Túbulo Proximal

1. Eutanasiar el pez cebra adulto inyectado con dextrano colocándolo en un plato con tricaína al 0,2% pH 7,0 durante 4-5 min.
   nota: Asegúrese de que el pez haya sido sacrificado antes de continuar, controlando cuidadosamente si las branquias han dejado de moverse y el corazón ha dejado de latir.
2. Con una cuchara de plástico, levante el pescado de la solución de tricaína, decante la solución y coloque al animal sobre un pañuelo de papel o una toalla de papel.
3. Use un par de tijeras de disección afiladas para hacer un corte detrás del opérculo branquial y retire la cabeza.
4. Abra inmediatamente el cuerpo del pez con las tijeras de disección haciendo una larga incisión ventral desde la cabeza hasta la base de la aleta caudal.
5. Retire los órganos internos del pez con un par de pinzas finas.
6. Utilice agujas de disección superfinas para abrir las paredes del cuerpo y permitir la visualización del órgano renal, que está adherido a la pared dorsal del animal.
7. Use pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal.
8. Coloque suavemente el riñón en un frasco de vidrio de 5 ml que contenga 1X PBS y lávese 3 veces con 3-5 mL de 1X PBS fresco durante 5 minutos cada uno.
   nota: El uso de un vial de vidrio para el manejo de muestras de riñón en adultos facilita la visualización del tejido y permite lavados con grandes volúmenes (en relación con la masa de tejido) de aproximadamente 3-5 mL. Alternativamente, se puede utilizar una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Mientras que se puede utilizar un tubo de microcentrífuga de plástico, los tubos de tamaño estándar (1,5 mL) pueden restringir el lavado.
9. Extraiga el riñón con una pipeta de transferencia y colóquelo en un portaobjetos de vidrio limpio con 1 o 2 gotas de 1X PBS.
10. Use pinzas finas, aplaste el riñón en el portaobjetos, asegurándose de que ningún tejido se haya curvado o volcado sobre sí mismo.
    nota: Alternativamente, se puede usar una herramienta de alambre de tungsteno para hacer pequeñas incisiones en el tejido conectivo para facilitar la posición aplanada del riñón.
11. Coloque pequeños trozos de arcilla para modelar en cada esquina de un cubreobjetos de vidrio de 18 x 18 mm y coloque lentamente el cubreobjetos en el riñón.
    nota: Incline ligeramente el cubreobjetos durante la colocación para minimizar el atrapamiento de burbujas de aire en la solución. Las hendiduras de arcilla para modelar tienen aproximadamente 2 mm de diámetro (Figura 1A). Alternativamente, se pueden sustituir las hendiduras de grasa al vacío en lugar de arcilla para modelar. Agregue una gota adicional de 1X PBS para llenar el espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio si es necesario.
12. Observe y/o obtenga imágenes del riñón colocando el portaobjetos de vidrio en el campo de visión de un microscopio estereoscópico o un microscopio compuesto con el filtro adecuado.

Resultados

Figura 1. Preparación y aplicación de riñón adulto para visualizar la absorción de dextrano conjugado en el segmento PCT de las nefronas renales. (A)Imagen de campo claro de una preparación de montaje plano de un espécimen de riñón, en el que el órgano se ha colocado plano sobre un portaobjetos de vidrio, con un cubreobjetos colocado encima del tejido que descansa sobre cuatro hendiduras de arcilla p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1X PBS			Se elabora diluyendo 10 X PBS en agua destilada.
Pinzas finas	Roboz	RS-1050	Patrón de pinzas Dumont #55
Corredera de vidrio	Termo-Fisher	4445	Escarcha blanca
Cubreobjetos de vidrio	Termo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Plastilina	Hasbro	Plastilina	Otras arcillas para modelar pueden ser sustituidas y funcionan de manera similar.
Soporte de corredera	Termo-Fisher	12-587	Opcional: bandeja de cartón para guardar las guías planas.
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Azul GFP/DAPI; 83457 P-Dotación GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	El conjunto de filtros utilizado fue el siguiente: Se utilizó filtro Hoechst/DAPI para la detección de DAPI, yoduro de propidio, azul de cascada de dextra y fosfatasa alcalina. Se utilizó filtro GFP/FITC para la detección de dextrano-FITC, amarillo de lucifer dextrano y antiGFP. El filtro TRITC se utilizó para la detección de dextrano-fluoro-rubí, PI y DBA.
Microscopio compuesto	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Rojo	El conjunto de filtros utilizado fue el siguiente: Se utilizó filtro Hoechst/DAPI para la detección de DAPI, yoduro de propidio, azul de cascada de dextra y fosfatasa alcalina. Se utilizó filtro GFP/FITC para la detección de dextrano-FITC, amarillo de lucifer dextrano y antiGFP. El filtro Texas Red se utilizó para la detección de dextrano-fluoro-rubí, PI y DBA.