Despigmentación y pretinción del riñón de pez cebra: una técnica para preparar el riñón de pez cebra adulto para la tinción

Resumen

Fuente: McCampbell, K. K. et al. Análisis de la composición y función de las nefronas en el riñón adulto del pez cebra. J. Vis. Exp. (2014)

En este video, demostramos la despigmentación del riñón de pez cebra adulto y su posterior preparación para los procedimientos de tinción. Después de la tinción, el riñón de pez cebra adulto se puede utilizar para estudiar la regeneración renal, la caracterización fenotípica de modelos de enfermedad renal y la funcionalidad de la nefrona.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Fijación, disección, permeabilización y eliminación de la pigmentación del riñón de pez cebra adulto

1. Prepare una solución fijadora fresca de 4% de paraformaldehído (PFA)/1X PBS/0,1% DMSO o descongele una alícuota congelada de 4% PFA/1X PBS y agregue 0,1% DMSO.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y las soluciones de PFA deben manipularse en una cubierta química mientras se usa el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y una bata de laboratorio. Además, el polvo de PFA debe manipularse con cuidado al preparar la solución madre.
2. Llene una bandeja de disección con suficiente solución fijadora para sumergir todo el animal.
3. Eutanasiar y montar el pez cebra seleccionado en solución de fijación.
   nota: El pez seleccionado puede ser una muestra de riñón de pez cebra no tratada o un riñón aislado de un pez cebra que recibió previamente una inyección intraperitoneal de dextrano.
4. Fije el O/N de la muestra (12–16 h) a 4 ^oC.
5. Al día siguiente, use pinzas finas para separar cuidadosamente el riñón de la pared dorsal del cuerpo y coloque el órgano en un frasco de vidrio con una pipeta >NOTA: Alternativamente, se puede usar un plato de cultivo de 12 o 24 pocillos. Mientras que se podía utilizar un tubo de microcentrífuga de plástico, los tubos de tamaño estándar (1,5 mL) podían restringir el lavado.
6. Lave el riñón disecado 3 veces con 3-5 mL de 1X PBS con 0.05% Tween durante 5 min cada uno.
7. Retirar el 1X PBS con 0,05 % de Tween y enjuagar el riñón con 3 mL de una solución de sacarosa al 5% (en 1X PBS) durante 30 min.
8. Reemplácelo con 3 mL de solución de sacarosa al 30% (en 1X PBS) y almacene O/N (12-16 horas) a 4 ^oC.
   NOTA: Las soluciones de sacarosa permeabilizan las membranas celulares, permitiendo posteriormente el marcaje específico de los reactivos a medida que penetran en el tejido.
9. Al día siguiente, retire la solución de sacarosa al 30% y lave el riñón 2 veces con 5 mL de 1X PBS con 0.05% Tween durante 5 min cada uno.
10. Reemplace el 1X PBS con 0.05% Tween con 3-5 mL de solución blanqueadora para eliminar la pigmentación de melanocitos presente en el órgano renal.
11. Coloque el frasco de vidrio en un rotador y observe cuidadosamente cómo desaparece la pigmentación.
    NOTA: La despigmentación suele tardar aproximadamente 20 minutos cuando se realiza después del tratamiento con sacarosa, pero en ocasiones puede tardar hasta 60 minutos. Si la solución blanqueadora se deja en el riñón durante demasiado tiempo, puede producirse la desintegración del órgano; Se aconseja monitorizar la muestra cada 10-15 minutos para comprobar la integridad del tejido.
12. Cuando se haya eliminado la pigmentación del riñón, lávese dos veces con 3-5 ml de 1X PBS con 0.05% de Tween.
13. Reemplace el PBS 1X con Tween al 0,05 % con 3 a 5 ml de solución de PFA al 4 % durante 1 hora en RT.
14. Retire la solución de PFA al 4% y lave el riñón 3 veces con 3-5 mL de PBS 1X con 0.05% Tween durante 5 minutos cada uno.
    NOTA: Una vez que se completa la fijación, el riñón también se puede montar en un portaobjetos de vidrio y evaluar la absorción de dextrano sin la pigmentación de los melanocitos.
15. Retire el PBS 1X con 0.05% de Tween y reemplácelo con 3-5 mL de solución de bloqueo, luego incube el riñón a RT en el bloque durante 2 horas.
16. Una vez finalizado el bloqueo, proceda directamente al protocolo de tinción seleccionado.
    NOTA: El riñón ahora se puede procesar a través de uno o más procedimientos para realizar estudios de etiquetado con diferentes reactivos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1X PBS			Elaborado diluyendo 10X PBS en agua destilada
1X PBST			0,1% Detergente Tween-20 en 1X PBS
1X PBS con 0.05 % Tween			0.05% Detergente Tween-20 en 1X PBS
Preadolescente 20	Bioanalítica Americana	AB02038
4% PFA/1X PBS			Disuelva el 4% de PFA (w/v) (Electrónica Microscopy Sciences, Cat #19210) en 1X PBS, deje hervir en una placa caliente en una campana extractora. Enfríe y congele las alícuotas para almacenarlas en el congelador a -20 °C. Descongele justo antes de usar y no vuelva a congelar las existencias
Solución blanqueadora			Fórmula de la mezcla de lejía (para una solución de 20 ml): 1,6 ml de solución de hidróxido de potasio al 10% 0,6 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 30% 100 μl de 20% Tween Llene hasta 20 ml con agua destilada
Hidróxido de potasio	sigma	221473
Peróxido de hidrógeno	sigma	H1009
Solución de bloqueo			Solución bloqueante (para una solución de 10 ml): 8 ml de 1X PBS con 0,05% Tween 2 ml de suero fetal para terneros 150 μl de DMSO