Patología de expansión: un método para la obtención de imágenes ópticas de alta resolución de muestras de tejido clínico

Resumen

Fuente: Klimas, A. et al. Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano mediante expansión física e isotrópica.J. Vis. Exp.(2019)

En este video, describimos un método llamado patología de expansión, una variante de la microscopía de expansión, en la que las muestras de tejido clínico se expanden químicamente utilizando una red de polímeros para el examen microscópico de estructuras a nanoescala.

Protocolo

1. Polimerización in situ de muestras

1. Incubar el espécimen en una solución de anclaje.
   1. Prepare la solución de anclaje (normalmente 250 μL son suficientes para cubrir la sección de tejido) diluyendo la solución madre de AcX en 1x PBS a una concentración de 0,03 mg/mL para muestras fijadas con fijadores no aldehídos o de 0,1 mg/mL para muestras fijadas con fijadores de aldehído, que tienen menos aminas libres disponibles para reaccionar con AcX.
   2. Coloque el portaobjetos en una placa de Petri de 100 mm y pipetee la solución de anclaje sobre el tejido. Incubar durante al menos 3 h a RT o toda la noche a 4 °C.
2. Incubar las muestras en solución gelificante.
   1. Prepare al menos 100 veces el exceso de volumen de la solución gelificante. Por 200 μL, combine lo siguiente, en orden: 188 μL de solución de monómero, 4 μL de solución madre 4HT al 0,5% (dilución 1:50, concentración final: 0,01%), 4 μL de solución madre TEMED al 10% (dilución 1:50, concentración final 0,2%) y 4 μL de solución madre APS al 10% (dilución 1:50, concentración final 0,2%).
      NOTA: La solución gelificante debe prepararse inmediatamente antes de usar. La solución debe mantenerse a 4 °C y la solución de APS debe añadirse al final, para evitar la gelificación prematura.
   2. Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa de Petri de 100 mm. Añadir una solución gelificante fresca y fría a la muestra e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 °C, para permitir la difusión de la solución en el tejido.
3. Construya una cámara en el portaobjetos alrededor de la muestra (Figura 1A) sin alterar la solución gelificante.
   1. Haga espaciadores para la cámara de gelificación cortando finamente trozos de cubreobjetos con un cuchillo de diamante.
      NOTA: Para facilitar la obtención de imágenes después de la expansión, los espaciadores deben tener un grosor similar al de la muestra de tejido para reducir la cantidad de gel en blanco por encima del tejido. El vidrio número 1,5 se puede utilizar para muestras clínicas estándar (5-10 μm). Las piezas de vidrio de cobertura se pueden apilar para obtener muestras más gruesas.
   2. Asegure los espaciadores a cada lado del tejido con gotas de agua (~10 μL).
   3. Coloque con cuidado una tapa de vidrio sobre el portaobjetos, asegurándose de evitar que las burbujas de aire queden atrapadas sobre el pañuelo (Figura 1B).
4. Incubar la muestra a 37 °C en un ambiente humidificado (como una placa de Petri cerrada con una toallita húmeda) durante 2 h.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La cámara de portaobjetos se puede almacenar dentro de una placa de Petri sellada a 4 °C.

>2. Digestión de muestra

1. Retire la tapa de la cámara de gelificación deslizando suavemente una hoja de afeitar por debajo del cubreobjetos y levantando lentamente el cubreobjetos de la superficie del gel. Recorta el gel en blanco alrededor del pañuelo para minimizar el volumen. Corte el gel asimétricamente para rastrear la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra se volverá transparente.
   1. Diluya ProK en 1:200 en tampón de digestión (concentración final 4 U/mL) antes de usar. Prepare suficiente solución para sumergir completamente el gel; un solo pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de cuatro pocillos requiere al menos 3 mL por pocillo.
   2. Incubar la muestra en un recipiente cerrado que contenga el tampón de digestión durante 3 h a 60 °C. Si la muestra no se desprende del portaobjetos durante la digestión, utilice una cuchilla de afeitar para extraer suavemente la muestra><. NOTA: La muestra debe sumergirse completamente en un tampón de digestión para evitar que la muestra se seque y colocarse en un recipiente tapado (caja de portaobjetos pequeña, pozo de plástico, placa de Petri, etc.) que se pueda sellar con película.

>3. Expansión de la muestra e imágenes

1. Utilice un pincel suave para transferir la muestra a 1x PBS en un recipiente compatible con el sistema de imágenes deseado y lo suficientemente grande como para acomodar el gel completamente expandido. Asegúrese de que el tejido esté colocado con el lado de la muestra hacia abajo si se toman imágenes en un sistema invertido o hacia arriba si se toman imágenes en un sistema vertical para minimizar la distancia desde el objetivo de la imagen hasta la muestra. Dale la vuelta al gel con un pincel suave si es necesario.
   nota: La iluminación lateral de un LED se puede utilizar para hacerlos visibles en líquido. Una placa estándar de 6 pocillos puede acomodar muestras que tienen un diámetro preexpandido inferior a 0,6 cm. Se debe usar una placa de pocillo con fondo de vidrio para obtener imágenes en un sistema invertido.
2. Lave las muestras en 1x PBS en RT durante 10 min. Si lo desea, vuelva a teñir la muestra con DAPI de 300 nM a medida que el proceso de digestión elimina la tinción de DAPI. Eliminar el PBS y la mancha con 300 nM de DAPI diluido en 1x PBS durante 20 min en RT, seguido de un lavado de 10 min con 1x PBS en RT.
   NOTA: Las muestras pueden cubrirse con 1x PBS y almacenarse a 4 °C antes de continuar con el siguiente paso.
3. Para ampliar las muestras, reemplace el PBS y lave con un volumen excesivo de ddH₂O (al menos 10 veces el volumen final del gel) 3-5 veces durante 10 minutos cada una, a RT.
   nota: Después del^3º o^4º lavado, la expansión del espécimen debería comenzar a estabilizarse. Para el almacenamiento, para evitar el crecimiento bacteriano, el ddH₂O se puede complementar con azida de sodio (NaN₃) al 0,002%-0,01%. En este caso, el factor de expansión final se reduce reversiblemente en un 10%.
4. Realice imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio de campo amplio convencional, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección.
   nota: Para evitar que los geles se desplacen, se puede eliminar el exceso de líquido del pozo. Los geles también se pueden inmovilizar con 1,5-2% de agarosa de bajo punto de fusión. Prepare 1.5-2% (p/v) de agarosa de bajo punto de fusión en agua en un recipiente de 2-4 veces el volumen de la solución. Calentar la solución en un baño de agua a 40 °C o en un microondas durante 10-20 s para derretir la solución. Pipetea la agarosa derretida alrededor de los bordes del gel. Después de dejar que la agarosa se endurezca a RT o 4 °C, agregue agua a la muestra para evitar la deshidratación.

Resultados

Figura 1: Cámara de gelificación para muestras de patología. (A) Dos espaciadores, como dos piezas de cubreobjetos #1.5 cortadas con un cuchillo de diamante, se colocan a cada lado del tejido después de incubar la muestra en solución gelificante a 4 °C. Los espaciadores deben ser más gruesos que los cortes de tejido, para evitar la compresión de la muestra. (...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa con fondo de vidrio de 6 pocillos (cubreobjetos #1.5)	Cellvis	P06-1.5H-N
acetona	Fischer Scientifc	A18-500
acrilamida	Sigma Aldrich	A8887
Acriloil-X SE, (AcX)	Invitrogen	A20770
agarosa	Fischer Scientifc	BP160-100
Persulfato de amonio (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Iniciador
DAPI (1 mg/mL)	Termo Científico	62248	Mancha nuclear
Cuchillo de diamante n.º 88 CM	Herramientas generales	31116
etanol	Farmacia	111000200
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
Muestra de riñón FFPE	USBiomax	HuFPT072
fórceps
Micro cubierta de vidrio #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cubierta de vidrio #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N",N"-tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	acelerador
N,N'-metilenebisacrilamida	Sigma Aldrich	M7279
Placa de cultivo celular Nunclon de 6 pocillos	Termo Fisher	140675
Nunc 15 mL Cónico	Termo Fisher	339651
Nunc 50 mL Cónico	Termo Fisher	339653
Agitador orbital
Pincel
Medidor de pH
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x	Fischer Scientifc	BP399-1
Placa de Petri de plástico (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinasa K (grado de biología molecular)	Termo Científico	EO0491
cuchilla	Fischer Scientifc	Año 12640
Tubos de microcentrífuga Safelock 1,5 mL	Termo Fisher	3457
Tubos de microcentrífuga Safelock 2.0 mL	Termo Fisher	3459
Acrilato de sodio	Sigma Aldrich	408220
cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S6191
Citrato de sodio tribásico dihidratado	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Base Tris	Fischer Scientifc	BP152-1
Tritón X-100	Sigma Aldrich	T8787
xileno	Sigma Aldrich	214736