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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Acceso lateral con pipeta al riñón por debajo de una columna de imágenes de líquido a través de un procedimiento quirúrgico novedoso
NOTA: El montaje del sistema de soporte de imágenes y la preparación quirúrgica se muestra en la Figura 1. El procedimiento descrito se realiza en ratones C57BL/6 con un peso de 20 a 25 g.
- Pesa el ratón.
- Inducir la anestesia con isoflurano al 4% y mantener con isoflurano al 1,5-2,5% en una mezcla de aire y oxígeno. Confirmar que el ratón está anestesiado por ausencia de respuesta a estímulos dolorosos y reducción de la frecuencia respiratoria.
- Lubrique los ojos y coloque el lateral del animal sobre una placa base. Inmoviliza 4 extremidades con cinta adhesiva.
- Inyecte solución salina normal, 200 μL, por vía subcutánea y coloque una sonda de temperatura rectal. Controle la temperatura con una lámpara térmica durante la cirugía y una almohadilla térmica durante la toma de imágenes.
- Retira todo el vello del lado izquierdo del ratón con una crema depilatoria.
- Localiza el bazo, que es visible debajo de la piel, y localiza el riñón izquierdo en el lado dorsal y caudal del bazo.
- Haga una incisión de 0,5 cm en la piel y una incisión más pequeña en el peritoneo, lo suficiente para que el riñón pueda atravesarla fácilmente.
- Extruya el riñón con una presión suave. Coloque un estabilizador de riñón hecho con polisiloxano alrededor del riñón y fíjelo con adhesivo de cianoacrilato. Alinee el riñón con el espaciador de manera que la superficie más lateral del riñón se extienda más allá del estabilizador en aproximadamente 1 mm.
- Fije una placa de cabeza a la forma del estabilizador con pegamento y monte la placa de cabeza en las barras de montaje de la placa base.
- Llene el pocillo en el soporte de polisiloxano que rodea el riñón con solución de agarosa al 1% y coloque el cubreobjetos de 10 mm encima y manténgalo hasta que la agarosa esté firme. Selle el cubreobjetos a la placa de la cabeza con pegamento y cree un anillo alrededor del cubreobjetos con cemento dental.
- Inyecte FITC-dextrano (2.000.000 Da, solución al 5%, 100–150 μL) por vía retroorbital y mueva rápidamente el ratón y la placa de fijación a la platina del microscopio de 2 fotones, manteniendo la anestesia y asegurando una eliminación adecuada de los gases residuales en la platina del microscopio.
>2. Selección de un glomérulo y una pipeta adecuados Acceso al espacio de Bowman
- Definiciones:
- Defina X como izquierda-derecha en la pantalla e izquierda-derecha mirando hacia el microscopio
- Leer SX (etapa X) desde el controlador de etapa
- Defina PX como pipeta X, en el controlador del dial de pipeta
- Defina Y como arriba-abajo en la pantalla y hacia adelante hacia el microscopio y de vuelta hacia la configuración de 2 fotones
- Defina Z como hacia el techo, hacia abajo hacia el suelo y medido en el escenario con la posición Z del objetivo.
- Define S(O)Z como la altura del escenario (en realidad, el objetivo).
- Encuentre la superficie del riñón, identificable mediante la configuración del filtro de proteína fluorescente verde (GFP) en el ocular. Debido a la inyección de FITC-Dextrano, la vasculatura será de color verde brillante.
- Identifique un glomérulo adecuado. Después de identificar la superficie del riñón con el ocular, cambie a 2 fotones (modo sin exploración) y explore la ventana de imágenes. Las características favorables para la micropunción son las siguientes: distancia vertical por debajo del cubreobjetos >30 μm (para evitar colisiones entre la pipeta y el cubreobjetos durante el acceso) y distancia lateral desde la cápsula lateral del riñón hasta el glomérulo <400 μm (más allá de esta distancia, la desviación de la pipeta puede aumentar la probabilidad de un error).
- Registre la distancia lateral y vertical hasta el punto de punción, un punto de la cápsula renal directamente al lado de la pipeta del glomérulo.
- Eleve el punto focal del objetivo en la columna de agua, manteniendo las coordenadas de la etapa x e y sin cambios, aproximadamente un centímetro.
- Introduzca la punta de la pipeta en la columna de agua y active la excitación por 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Mueva la pipeta en las dimensiones x e y hasta el punto de máxima fluorescencia de la punta, este será el centro del objetivo. Encontrar la pipeta en el ocular es difícil sin esta preposición precisa. Debido a que los puntos cuánticos emiten fluorescencia a la misma longitud de onda (en este caso, roja) independientemente de la longitud de onda de excitación, la excitación DAPI produce fluorescencia roja, que se enfoca estrechamente en la punta, como se ilustra en la Figura 2.
- Cambie la configuración de excitación a proteína fluorescente roja (RFP) y visualice la pipeta en el ocular, luego céntrela con precisión en la vista ocular.
- Cambie a 2 fotones y busque la pipeta debajo de 2 fotones, colocándola precisamente en el centro de la imagen. Esta es la posición de registro.
- Guarde una imagen de la pipeta.
- Registre la etapa y las coordenadas del controlador de micropipetas.
nota: Utilice el archivo de .html complementario, que ejecutará los cálculos utilizando código JavaScript (ventajoso en sistemas que no tienen instalado un software de hoja de cálculo) o una hoja de cálculo para calcular el desplazamiento entre las coordenadas de la etapa y la pipeta y para calcular las coordenadas de destino para el controlador de pipetas.
- Retire la pipeta de la columna de agua en el eje x, manteniendo z e y iguales.
- Mueva la pipeta Z al glomérulo objetivo Z (es decir, mueva la pipeta hacia abajo en la dirección Z por debajo del cubreobjetos)
- Mueva la pipeta Y a la coordenada Y del glomérulo objetivo.
- Mueva la vista en vivo de 2 fotones al glomérulo objetivo Z y luego al borde del riñón y observe el SX.
- Calcule el borde del riñón PX utilizando el desplazamiento del registro SX.
- Mueva la platina hacia la pipeta (aumente el SX) de modo que el borde del riñón quede muy a la izquierda de la pantalla, pero aún visible.
- Avance la pipeta rápidamente hasta aproximadamente 100 μm menos que el borde del riñón PX calculado anteriormente.
- Localice la punta de la pipeta, avanzando la pipeta lentamente. Aumente la ganancia de rojo y observe el histograma de píxeles rojos (la distribución de píxeles cambia antes de que se muestre la pipeta en la ventana, debido al brillo extremo de los puntos cuánticos y la fluorescencia fuera del objetivo).
- Avance hasta el borde del riñón bajo imágenes vivas de 2 fotones.
nota: Antes de entrar en la cápsula renal, es posible redirigir la pipeta en las dimensiones Y y Z. Sin embargo, esto puede romper la punta de la pipeta. Una medida más conservadora, si la pipeta está fuera del objetivo, es retirarse en la dimensión X hasta 2 cm, redirigir y luego regresar en la dimensión X al borde del riñón. Una vez que la pipeta está dentro del tejido, el movimiento en cualquier eje que no sea X conduce a la flexión de la pipeta, que requiere una gran experiencia para su uso y, con frecuencia, conduce a la rotura.
- Conduzca la pipeta en el eje X lentamente hasta el glom target PX, sin perder de vista el SX. (Es útil volver de vez en cuando al glomérulo para ver si se ha desplazado en absoluto al insertar la micropipeta).
- Cuando esté en la ubicación correcta, coloque el documento con un z-stack.
nota: Con la micropipeta colocada, se pueden inyectar fármacos, proteínas o trazadores fluorescentes, se puede aspirar líquido para su posterior análisis o se puede medir la presión o la carga relativa a otro electrodo.
>3. Aspiración de fluido del espacio de Bowman
- Configure la microbomba para inyectar 100 nL de perfluorodecalina durante 2 minutos para garantizar la permeabilidad de la pipeta y reducir las confusiones causadas por la obstrucción de la pipeta durante la entrada. Vuelva a crear una imagen para asegurarse de la posición de la pipeta.
- Espere de 4 a 6 minutos para una filtración adicional.
- Ajuste la microbomba para aspirar hasta 300 nL a una velocidad de hasta 50 nL/min.
nota: No se observan cambios en la morfología glomerular con esta tasa, lo que sugiere que no altera la tasa de entrega de líquido al espacio durante la aspiración. Al no existir un bloque de aceite como en la micropunción convencional, la recuperación de este volumen, necesaria para la espectrometría de masas, podría incluir parte de la perfluorodecalina inyectada y, posiblemente, líquido tubular. Para ensayos como mediciones de electrodos sensibles a iones, espectroscopia de fluorescencia, reacción en cadena de la polimerasa y otros criterios de valoración sensibles, se pueden utilizar volúmenes más bajos. Si la espectrometría de masas no es el criterio de valoración, se pueden utilizar técnicas estándar de aceite mineral y micropunción para medir el volumen aspirado antes del almacenamiento.
- Imagen una vez más.
- Retire la pipeta y conserve la muestra, añadiendo tampón TRIS y almacenándola a -80° antes del análisis.
- Aplicar la eutanasia al ratón utilizando una sobredosis de isoflurano u otro método aprobado.
nota: El filtrado entra en el espacio por filtración desde los capilares glomerulares. La tasa de filtración glomerular de una sola nefrona (SNGFR) en ratones se registra entre 8 y 14 nL/min. Sin embargo, las fuerzas de Starling gobiernan el SNGFR y, por lo tanto, la presión hidrostática negativa en el espacio de Bowman puede aumentar el SNGFR. Los métodos estándar de micropunción utilizan bloqueo tubular con aceite y presión neutra para el muestreo de fluidos tubulares, sin embargo, estos compuestos interfieren con la espectrometría de masas (ver más abajo); Por lo tanto, en esta técnica el túbulo proximal temprano permanece permeable. Además, en el momento de la aspiración, el espacio de Bowman contiene un volumen desconocido, pero positivo, de filtrado. Por lo tanto, la tasa de aspiración de líquidos puede exceder SNGFR.
nota: En los experimentos aquí descritos, el objetivo era obtener una muestra de filtrado glomerular más grande de lo habitual para el análisis de espectrometría de masas mediante técnicas nanoproteómicas. Dado que el uso de la espectrometría de masas impide el uso de bloques de aceite con aceite mineral o cera (mezclas complejas de moléculas orgánicas que reducen el ruido de la señal en la espectrometría de masas), se utiliza perfluorodecalina para llenar la micropipeta y la jeringa. No se sabe que la perfluorodecalina bloquee el flujo tubular, pero es biológicamente inerte y no interfiere con la espectrometría de masas.
