Cultivo organotípico renal en CAM de pollo: una técnica para el trasplante de explantes de riñón murino en CAM de pollo para inducir la formación de arquitectura vascular renal

Resumen

Fuente: Kaisto, S. et al. Optimización del cultivo organotípico y de organoides renales para la vascularización, el desarrollo extendido y la mejora de las imágenes microscópicas. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un método para estudiar el desarrollo de órganos utilizando una configuración mejorada de xenotrasplante en membrana corioalantoidea (CAM) de embriones aviares. Este método permite el desarrollo de órganos embrionarios y organoides cultivados completamente vascularizados.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE

1. Fabricación de minireservorios para el cultivo de riñones embrionarios de ratón y organoides renales en CAM de pollo y creación de experimentos de xenotrasplante

1. Utilice insertos de cultivo celular transwell diseñados para placas de 6 o 12 pocillos.
   nota: Dependiendo del experimento en particular, se pueden utilizar minidepósitos grandes o pequeños. Es mejor usar minireservorios pequeños para xenoinjertar hasta ocho riñones embrionarios o cuando se van a colocar varios minireservorios en el mismo embrión de pollo (por ejemplo, muestras de experimento y control en el mismo CAM de pollo).
2. Corte los lados de los insertos con una multiherramienta giratoria con una hoja de sierra circular o una sierra de mano para crear un anillo de plástico de 2 mm de altura con una membrana permeable adherida a él.
3. Pule los bordes de estos minidepósitos con un bisturí o un cuchillo afilado.
4. Esterilizar los minidepósitos en etanol al 70% durante al menos 1 h.
5. Lave los minidepósitos en agua bidestilada esterilizada en autoclave y déjelos secar en una campana laminar.
6. Enjuague los minidepósitos en PBS y medio de cultivo (DMEM con alto contenido de glucosa/10% FBS/1% con penicilina-estreptomicina).
7. Coloque el depósito en una placa de Petri, encima de una gota (600 μL/400 μL) de medio de cultivo con la membrana hacia arriba.
8. Coloque los riñones embrionarios o organoides renales disecados ex vivo de manera uniforme en la membrana con la ayuda de una pipeta o un tubo capilar de vidrio. Evite dejar mucho líquido alrededor de los riñones.
9. Deje que las muestras se adhieran a la membrana durante 2-24 h en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂.
   nota: En el pequeño inserto se pueden colocar hasta ocho riñones de ratón embrionarios E11.5 o organoides renales. Se recomienda el inserto grande si se van a utilizar trozos más grandes de tejido embrionario para el xenotrasplante o una mezcla de células e hidrogel en un área más grande de la MCA.
10. Sacar de la incubadora de cultivo celular pollos embrionarios cultivados ex ovo de 8 días de edad preparados de acuerdo con métodos publicados anteriormente
11. Transfiera los minireservorios a la CAM de modo que los injertos queden frente a la CAM y la membrana los superponga. Coloque los minidepósitos en la periferia de la CAM de modo que no cubran el embrión de pollo.
    nota: Cuando se utilizan los miniembalses más pequeños fabricados a partir de insertos de transpocillos para placas de 12 pocillos, se pueden colocar hasta tres minireservorios en un CAM.
12. Agregue 500 μL (inserto de 6 pocillos) o 300 μL (inserto de 12 pocillos) de medio de cultivo a los minidepósitos.
13. Cultive las muestras en CAM de pollo durante un máximo de 9 días. Reemplace diariamente el medio de cultivo en los minidepósitos.
    nota: La vascularización de las muestras puede observarse tan pronto como 24-48 h después del trasplante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora de células	Panasonic	13090543	Temperatura ajustada a 37 grados; C, 90% de humedad, 5% CO2
Incubadora de células	SANYO	10070347	Incubadora de cultivo CAM de pollos. Temperatura ajustada a 37 grados; C, 90% de humedad, 5% CO2
Medio del águila modificada de Dulbecco	Sigma	D777	Glucosa alta
Etanol (70%)	VWR
Suero fetal bovino	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Pinzas DUMONT #5	Dumont	#5SF^
PBS -/-	Corning	20-031-CV
Biowest	X0520-500	Lavado de los mini depósitos.
Penicilina y estreptomicina	Sigma	P4333
Insertos de cultivo celular de 12 pocillos Thincert con 0.4 y micro; membrana de poliestireno m-pore	Greiner Bio-One	665641
Insertos de cultivo celular de 6 pocillos Thincert con 0.4 y micro; membrana de poliestireno m-pore	Greiner Bio-One	657610

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