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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparar las unidades estereotácticas para la cirugía
- Encienda todas las máquinas de anestesia, básculas Vernier digitales e inyectores digitales.
nota: Todos los instrumentos quirúrgicos deben limpiarse y esterilizarse adecuadamente antes de la cirugía.
- Utilice máquinas de anestesia con un accesorio de cámara de inducción en un gabinete de seguridad biológica (Figura 1A).
- Asegúrese de que todos los tubos de las máquinas de anestesia estén conectados a los marcos estereotácticos (Figura 1B, recuadro 1C) y que las pinzas de los tubos estén abiertas para todas las unidades que se utilicen. Cierre las pinzas de los tubos que van a los marcos estereotácticos que no se usarán para la cirugía.
- Ajuste las máquinas de anestesia al caudal del cono de la nariz recomendado por el fabricante en función del peso del ratón (p. ej., 25 g de peso del animal: caudal del cono de la nariz 34 mL/min).
nota: El soporte para la cabeza incluido en esta configuración estereotáctica se recomienda solo para ratones adultos. Asegúrese de seguir las recomendaciones del fabricante incluidas con la configuración estereotáctica.
- Asegúrese de que el anestésico apropiado (por ejemplo, isoflurano) precargado en la jeringa esté conectado a la máquina de anestesia (Figura 1B).
nota: El cebado excesivo de la jeringa puede hacer que se administre demasiada anestesia a los ratones durante la cirugía y provocar una sobredosis de anestésicos.
- Prepare las brocas girando el bloqueo de la etapa, insertando un adaptador de broca y una broca de 1 mm en cada taladro y bloquee el taladro apretando manualmente el bloqueo de la broca.
- Coloque los ejercicios en los marcos estereotácticos (Figura 1C).
>2. Colocar ratones en marcos estereotácticos
- Anestesiar ratones (por ejemplo, isoflurano) utilizando la cámara de inducción antes mencionada.
- Mantenga a los ratones durante todo el procedimiento en un plano anestésico profundo. El % de anestesia administrada por la máquina depende de una serie de factores, entre ellos: la tasa de flujo, el grado de estimulación y la temperatura corporal. Monitoree a los ratones con frecuencia durante todo el procedimiento para determinar la profundidad de la anestesia evaluando las respiraciones rítmicas (el animal no jadea); falta de reflejo palpebral (aleteo de los párpados cuando se estimula con un aplicador de punta de algodón); y falta de pellizco de los dedos de los pies (retirada de la extremidad ante el estímulo nocivo de pellizcar los dedos de los pies).
nota: Diferentes cepas de ratones tendrán una respuesta diferente a la anestesia.
- Después de que los ratones estén en un plano anestésico profundo apropiado, transfiéralos a la unidad estereotáctica. Utilice una almohadilla térmica mientras el ratón está en la máquina estereotáctica para mantener la temperatura corporal y un plano anestésico adecuado.
nota: Para lograr un perfil bajo, utilizamos calentadores de manos activados por aire colocados dentro de una caja de punta de pipeta invertida (caja elevadora de mouse en la Figura 1D).
- Abra la boca del ratón y coloque los dientes en el canal de la barra bucal ubicada en la pieza de la nariz en el marco estereotáctico (Figura 2A). Deslice el cono de la nariz sobre la nariz/boca del ratón (Figura 2B).
- Coloque los ratones con la cabeza nivelada con la barra de la boca. Abra suavemente la boca con el extremo romo de un aplicador de punta de algodón y deslícelo en su lugar. Asegúrese de que el cono de la nariz esté completamente sobre la nariz del ratón o la anestesia no se administrará correctamente. El cono de la nariz no se enganchará con la nariz si los dientes no están asentados dentro de este surco (Recuadro de la Figura 2A).
- Con un hisopo de algodón estéril, coloque lubricante ocular en cada uno de los ojos del ratón. La aplicación de lubricante ocular mitiga el secado de la córnea y reduce la posibilidad de daño corneal y complicaciones postoperatorias relacionadas con el traumatismo corneal.
- Estabilice el cráneo del ratón presionando la barra de la oreja izquierda contra el canto medial de la oreja izquierda, bloqueándola en su lugar con el tornillo del marco estereotáctico. A continuación, deslice la barra de la oreja derecha contra el canto medial de la oreja derecha y atornille firmemente el marco estereotáctico (Figura 2B).
nota: Asegúrese de que la cabeza del mouse esté nivelada y recta al colocar las barras para los oídos. Si la cabeza está torcida o inclinada, la inyección estará en el lugar incorrecto del cerebro. Las barras de los oídos deben apretarse SOLO hasta que el cráneo esté inmovilizado tras la estimulación con sondeo manual moderado.
>3. Hacer una ventana de calvario
- Prepare y limpie el cuero cabelludo con 3 pasadas alternas cada una de una solución de betadine y etanol al 70%. Debido a la proximidad del sitio quirúrgico a los ojos, use la solución de betadine sobre el exfoliante quirúrgico.
- Con un bisturí estéril, haga una incisión de 3 mm a través de la piel a lo largo de la cara media central del cráneo (siguiendo la línea de sutura sagital). El sangrado en la incisión debe ser mínimo. En caso de que ocurra, aplique una presión constante y firme en el sitio del sangrado con un aplicador estéril de punta de algodón durante >30 segundos.
- Identifique y oriente el taladro perpendicular al bregma (Figura 2C), asegurándose de restablecer la escala digital Vernier a cero.
- Mueva la fresa 2 mm lateral a la sutura sagital y 1 mm anterior a la sutura coronal (Figura 2C). Para la reproducibilidad, asegúrese de que la ubicación a la izquierda o a la derecha de la línea de sutura sagital permanezca constante para todos los animales.
- Gira el taladro a su velocidad más alta. Asegúrese de que la piel se aleje del taladro para evitar daños en el tejido causados por la broca giratoria e inicie con cuidado el taladro en el cráneo. Perfore un agujero de aproximadamente 0,5 mm de profundidad a través de la pantorrilla, dando como resultado la ventana de la pantorrilla. Tenga cuidado de no bajar demasiado el taladro o perforará el cerebro. Dejar caer solución salina estéril en el sitio de perforación mientras la perforadora está en movimiento puede compensar cualquier calor generado por la máquina que pueda causar daño térmico al tejido circundante.
- Una vez hecha la ventana de la pantorrilla, levante con cuidado el taladro y retírelo del marco estereotáctico.
- Limpie las brocas con etanol al 70% y déjelas a un lado si se vuelven a usar. De lo contrario, retire las brocas y sumérjalas en etanol al 70%.
