Ensayo de fagocitosis microglial: un ensayo in vitro para establecer un modelo de fagocitosis microglial para células de neuroblastoma utilizando macrófagos iPSC

Resumen

Fuente: Hall-Roberts, H. et al. Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por macrófagos iPSC. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, realizamos el ensayo de fagocitosis microglial para el neuroblastoma utilizando células madre pluripotentes inducidas. El ensayo ayuda a evaluar el deterioro de la función microglial en enfermedades neurodegenerativas.

Protocolo

>1. Etiquetado de SH-SY5Ys muertos con colorante fluorescente rojo sensible al pH

1. Comience con células fijas SH-SY5Y suspendidas en medios tamponados HEPES sin rojo fenol. Cuente las células y extraiga el número total de células necesarias en un tubo de baja unión a proteínas de 2 ml. Por cada 1 millón de SH-SY5Ys, compense el volumen total en el tubo de 2 ml a 300-500 μl con medios tamponados con HEPES sin rojo fenol. Calentar brevemente el tubo en un baño de agua a 37 °C.
2. Reconstituya el éster STP del colorante fluorescente rojo sensible al pH (consulte la Tabla de materiales) y agregue 12,5 μg de colorante por millón de SH-SY5Y al tubo tibio de 2 ml de celdas. Mezclar suavemente pipeteando. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 min, protegido de la luz.
   nota: La especie de éster STP del tinte sensible al pH reacciona con las aminas primarias y, por lo tanto, el tampón de etiquetado no debe contener aminas libres. Debido a la solubilidad potencialmente limitada en los tampones acuosos, agregue el colorante disuelto en DMSO solo para calentar el tampón acuoso, mezcle inmediatamente y examine en busca de signos de precipitado (partículas oscuras bajo un microscopio óptico).
3. Añadir 1 mL de HBSS y centrifugar a 1200 x g durante 7 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lavar con 2 mL de HBSS. Repita la centrifugación.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en medios macrófagos libres de rojo fenol (consulte la Tabla de materiales) hasta una concentración de 200.000-1,2 millones de células/mL, de modo que 50 μL sean 10.000-60.000 células (es decir, 0,5x-3x más SH-SY5Ys que macrófagos iPSC).
   nota: El rojo de fenol en los medios aumenta la fluorescencia de fondo y, por lo tanto, se deben usar medios sin rojo de fenol si se van a realizar imágenes de células vivas. No se recomienda almacenar el SH-SY5Ys teñido durante más de unas pocas horas, ya que esto no se ha evaluado. Mantenga los SH-SY5Ys manchados en hielo y protéjalos de la luz.

>2. Tinción de macrófagos iPSC

1. En un gabinete de seguridad biológica, prepare una solución en medios macrófagos de un colorante reactivo al éster de succinimidilo de color rojo fluorescente intenso, permeante a las células (consulte la Tabla de materiales). Añada Hoechst 33342 (consulte la tabla de materiales). Calentar la solución de trabajo a 37 °C en un baño de agua.
2. Aspire suavemente el medio iPSC-macrófago pipeteando el sobrenadante celular con una pipeta multicanal en un depósito estéril. Añada 70 μL/pocillo de la solución de colorante preparada en el paso 2.1 a los macrófagos iPSC, utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Preparar tratamientos experimentales en medios macrófagos libres de rojo fenol. Incluir 10 μM de citocalasina D como tratamiento de control negativo. Después de la incubación, aspire el medio iPSC-macrófago muy suavemente con una pipeta multicanal y agregue 100 μL/pocillo de la solución salina tamponada de Hank (HBSS) para lavar. Elimine inmediatamente el HBSS mediante un pipeteo suave y, a continuación, añada 100 μl de medios ± compuestos. Incubar durante 10 min–1 h a 37 °C y 5% de CO₂.
   nota: La citocalasina D es un potente inhibidor de la actina y bloquea la fagocitosis. Para cualquier tratamiento experimental que requiera una incubación más larga, por ejemplo, de 24 a 72 h, realice el tratamiento experimental antes del paso 2.1, utilizando 100 μL/pocillo de tratamiento en medios de macrófagos completos. Siga los pasos 2.1 a 2.3 según el protocolo para que se realice la tinción celular y, posteriormente, se vuelva a aplicar el tratamiento en medios de macrófagos sin rojo de fenol para el resto del ensayo de fagocitosis.

>3. Fagocitosis de imágenes

1. Imágenes de alto contenido de célula fija
   1. Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 μL de los SH-SY5Ys marcados por pocillo, añadiéndolos al lado de cada pocillo en el borde del líquido. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 3-5 h.
   2. Después de la incubación de la fagocitosis, aspire suavemente los sobrenadantes celulares pipeteando con una pipeta multicanal y deséchelos. Lavar una vez con 100 μL de PBS.
   3. Fijar la placa mediante la adición de 100 μL de paraformaldehído al 2% e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
   4. Aspirar los pocillos y añadir 100 μL de PBS. Cubra con sellador de placas y papel de aluminio; almacenar a 4 °C hasta que se necesite.
      nota: La placa de ensayo puede almacenarse así durante al menos una semana sin que la señal se degrade significativamente; No se ha probado un almacenamiento más prolongado.
   5. Encienda el microscopio de imágenes de alto contenido (consulte la Tabla de materiales) y abra el software de captura de imágenes. Cargue la placa de ensayo en el microscopio haciendo clic en el icono Cargar en la parte superior de la pantalla.
   6. Seleccione la pestaña Configuración. En los menús desplegables del cuadro superior izquierdo: seleccione el tipo de placa apropiado, seleccione la opción de enfoque automático Dos picos (predeterminado), seleccione el objetivo 40x Agua, NA1.1, seleccione el modo Confocal y seleccione el binning de 1.
   7. Enjuague el objetivo de agua 40x antes de usarlo a través del menú Configuración.
   8. En el cuadro Selección de canal, use el icono + para agregar los canales DAPI, Alexa 647 y Alexa 568. Ajústelos para que midan en un solo plano de 1 μm. Optimice los ajustes de tiempo y potencia para la eficiencia de tinción de la placa de ensayo.
      nota: Como pauta, configure DAPI en 200 ms de exposición y 100% de potencia, Alexa 647 en 1500 ms de exposición y 100% de potencia, y Alexa 568 en 100 ms de exposición y 40% de potencia.
   9. Asegúrese de que los canales no se midan simultáneamente haciendo clic en Secuencia de canales para separar los canales.
   10. En Navegación | Defina el diseño, seleccione los pozos de medición y seleccione de 9 a 12 campos por pozo.
   11. Durante la configuración, haga clic en un campo representativo en el mapa de la placa y verifique cada canal de medición a su vez, para asegurarse de que la tinción esté presente y que las imágenes estén enfocadas, ajustando el desplazamiento del canal.
   12. Para que los datos se carguen en un servidor para su análisis remoto, haga clic en el cuadro Trabajos en línea y en el nombre de pantalla correspondiente; esto permitirá la carga automática de los datos en un servidor después de la toma de imágenes.
   13. Guarde el protocolo de ensayo haciendo clic en el botón Guardar.
   14. Haga clic en la pestaña Ejecutar experimento en la parte superior y asigne un nombre a la placa del experimento, luego haga clic en Iniciar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo centrífugo cónico de 15 mL	halcón	352096	Para la centrifugación de células
Micropipetas monocanal de 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
4% de paraformaldehído en PBS	Alfa Aesar	J61899	Para la fijación de células
Placa de 6 pocillos, tratamiento con cultivo de tejidos
AggreWell-800 Placa de 24 pocillos	Tecnologías STEMCELL	34815	Micropocillo de baja adherencia Placa de 24 pocillos para la formación de cuerpos embrioides
Contador de células automatizado
Centrífuga de sobremesa
Microcentrífuga de sobremesa
Microplacas CellCarrier-96 Ultra, tratamiento para cultivo de tejidos, negro, 96 pocillos con tapa	Perkin Elmer	6055302	Microplaca tratada con cultivo de tejidos (TC) de 96 pocillos con paredes negras y fondo ópticamente transparente, para el ensayo de fagocitosis
Software CellProfiler			Software de código abierto para el análisis de imágenes de fagocitosis obtenidas por microscopio de lapso de tiempo de células vivas. Descargue de forma gratuita desde el sitio web (http://cellprofiler.org/), este protocolo utiliza la versión 2.2.0.
Tinte CellTracker Deep Red	Termo Fisher	C34565	Colorante reactivo al éster de succinimidilo de color rojo fluorescente intenso permeante a las células para la tinción de citoplasma de macrófagos iPS. Disuelve el colorante CellTracker Deep Red en DMSO a 2 mM (1,4 mg/mL). Úselo a 1 μM, por dilución de caldo de DMSO con medios de macrófagos.
Cabina de seguridad de flujo de aire laminar de clase 2
Bombona de gas CO2			Accesorio para EVOS FL Auto
Incubadora de CO2, ajustada a 37 °C y 5 % de CO2
Citocalasina D	caimán	11330	Tratamiento de control negativo para el ensayo de fagocitosis. Reconstituya en DMSO a 10 mM y almacene las alícuotas a -20 °C, evite más ciclos de congelación y descongelación. Utilizar a la concentración final de 10 μM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Componente de los medios SH-SY5Y
Dmso	sigma	D8418	Disolvente para tintes CellTracker y pHrodo
Suero Fetal Bovino	sigma	F4135	Componente de los medios SH-SY5Y
Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido, sin LDEV, con calificación hESC	Invitrogen	A1413302	Matriz de membrana basal con calificación hESC para cultivo iPSC
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050-038	Componente de los medios de fábrica y macrófagos
HBSS	Lonza	BE 10-547F	La solución salina equilibrada de Hank para los pasos de lavado
IL-3 recombinante humana	Gibco	PHC0033	Componente de los medios de fábrica y macrófagos
Solución de adquisición de imágenes de células vivas	Termo Fisher	A14291DJ	Medios tamponados con HEPES sin rojo de fenol para el etiquetado de SH-SY5Ys muertos
Tubos de 2 mL de baja unión a proteínas	Eppendorf	30108.132	Para tinción SH-SY5Ys
M-CSF	Termo Fisher	PHC9501	Componente de los medios de fábrica y macrófagos
mTeSR1 Medio	Tecnologías STEMCELL	85850	Medios iPSC
Pipeta multicanal de 20-200 uL			Para el manejo de líquidos de placas de 96 pocillos
Reactivo NucBlue Live ReadyProbes	Termo Fisher	R37605	Formulación de Hoechst 33342 en un frasco gotero para teñir núcleos de macrófagos iPS, use 0,5 gotas/ml en medios de macrófagos.
Sistema de cribado de alto contenido Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14000000	Microscopio de imágenes de alto contenido, utilizado con la versión 4.9 del software Harmony.
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	Números 15140-122	Componente de medios de fábrica, macrófagos y SH-SY5Y
pHrodo iFL Rojo STP-Éster	Termo Fisher	P36011	Colorante fluorescente rojo sensible al pH para el etiquetado de SH-SY5Ys muertos. Reconstituya el polvo de éster rojo STP de pHrodo iFL en DMSO a una concentración de 5 mg/mL. Por cada 1 millón de SH-SY5Ys, agregue 2,5 μL (12,5 μg) de stock de éster pHrodo iFL Red STP a las células precalentadas suspendidas en la solución de imágenes de células vivas.
Relleno de pipetas serológicas
Matraz T175, tratado con cultivo de tejidos			Recipiente para la diferenciación de precursores de iPSC-macrófagos, conocidos como "Fábricas"
Matraz T75			Recipiente para el cultivo SH-SY5Y
Selladores de placas transparentes	Greiner Bio-One	676001	Para el almacenamiento y el transporte de placas de ensayo
Baño de agua, a 37 °C
X-VIVO 15 Medium con L-glutamina, gentamicina y rojo fenol	Lonza	BE04-418F	Componente de los medios de fábrica y macrófagos
X-VIVO 15 Medium con L-glutamina; sin gentamicina ni rojo de fenol	Lonza	04-744Q	Medios macrófagos libres de rojo fenol, para uso en fagocitosis sin aditivos ni factores de crecimiento