Aislamiento de núcleos de tejidos frescos congelados de glioma: un método para obtener núcleos intactos a partir de muestras de tumores de glioma

Resumen

Fuente: Narayanan, A. et al. Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe el protocolo para aislar núcleos individuales de tejido de glioma fresco congelado. Los núcleos individuales aislados se pueden utilizar como muestras para técnicas de secuenciación como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA) y el ensayo de un solo núcleo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATAC) para obtener una visión más profunda de la heterogeneidad inter e intratumoral observada en el glioma de los tejidos nerviosos centrales.

Protocolo

1. Disección y disociación de tejidos

1. Transfiera una muestra de tejido fresco congelado (10-60 mg) a una placa de Petri preenfriada. Picar el pañuelo fresco congelado con una cuchilla de afeitar en trozos pequeños con hielo.
2. Añada 500 μL de tampón de lisis de núcleos refrigerados a un tubo de 1,5 mL preenfriado. Coloque las piezas de tejido en el tubo de 1,5 mL que contiene el tampón de lisis de núcleos y transfiéralas a un Douncer (Tabla de Materiales).
   nota: Hay dos morteros homogeneizadores Dounce: mortero "suelto" o "A" para la reducción inicial de la muestra y mortero "apretado" o "B" para la homogeneización completa de la muestra.
3. Rebote los trozos de tejido con el mortero "suelto" durante unos 20 golpes, hasta que se reduzca la fricción. Si hay residuos, la muestra puede limpiarse previamente mediante filtración con un colador de 100 mm.
4. Remolque con el mortero "apretado" durante 20 pasadas para lograr una homogeneización completa del tejido.
5. Transfiera el homogeneizado (aproximadamente 500 μL) a un tubo de 2 mL previamente enfriado. Añadir 1 mL de tampón de lisis refrigerado. Mezclar suavemente e incubar en hielo durante 5 min. Mezcle suavemente con una punta de pipeta de diámetro ancho y repita 1 o 2 veces durante la incubación.
6. Filtre todo el homogeneizado con una malla coladora de 30 μm, recoja en un tubo Falcon de 15 ml y vuelva a transferirlo a un nuevo tubo preenfriado de 2 ml. Un solo colador suele ser suficiente para todo el homogeneizado.
7. Revise bajo un microscopio óptico para verificar la remoción de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe estar distorsionada. Si hay residuos, los núcleos se pueden volver a filtrar.
8. Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de sobremesa. Retire el sobrenadante, dejando ~50 μL con un pellet que contenga los núcleos. Vuelva a suspender suavemente el pellet en otro 1 ml de tampón de lisis de núcleos e incube durante 5 minutos en hielo.
9. Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4°C. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet, añadir 500 mL de tampón de homogeneización (HB) 1x (Tabla 1) e incubar durante 5 min sin resuspender. A continuación, vuelva a suspender los núcleos en otro 1,0 mL de 1x HB.
10. Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y resuspender suavemente los núcleos en 200 μL de 1x HB en un nuevo tubo de 2,0 mL.

    Tabla 1: Preparación de 1x solución tampón de homogeneización inestable (2 mL por muestra)

    horas

    1x Tampón de Homogeneización Solución Inestable (2 mL por muestra)
    Reactivo	Conc. Final	Vol por muestra (μL)
    6x Tampón de homogeneización inestable	1 vez	333.33
    1 M de sacarosa	320 mM	640.00
    50 mM de EDTA	0,1 mM	4.00
    10% NP40	0.1%	20.00
    H2O		1006.27

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol	sigma	M6250
CaCl2	sigma	21115-100ML
EDTA (0,5 M)	Termo Científico	R1021
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 mL	Fisher Científico	352096
MACS SmartStrainers (100 μm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	AB142227
Kit de aislamiento de núcleos: Nuclei EZ Prep	sigma	NUC101-1KT
Tubos de bloqueo seguro de 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Tubos de bloqueo seguro 2.0 mL	Eppendorf	30120094
sacarosa	sigma	S0389
Puntas de pipeta de diámetro ancho (1000 μL)	Themo Fisher Científico	2079GPK