Purificación de núcleos basada en centrifugación en gradiente: una técnica para obtener una fracción ultrapura de núcleos intactos mediante centrifugación en gradiente de densidad

Resumen

Fuente: Narayanan, A. et al. Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, describimos un protocolo simple y eficiente que utiliza la centrifugación en gradiente para aislar núcleos individuales. Una vez aislados, estos núcleos se pueden utilizar para la secuenciación y el análisis del genoma.

Protocolo

1. Centrifugación en gradiente

1. Añadir 200 μL de solución de yodixanol al 50% (Tabla 1) para obtener una concentración final de iodixanol al 25%. Mezclar bien 10 veces con una pipeta colocada en 300 mL.
2. Añadir 300 μL de solución de yodixanol al 29% (Tabla 2) bajo la mezcla al 25%. Utilice una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas.
3. Añadir 300 μl de solución de yodixanol al 35% (Tabla 3) bajo la mezcla al 29%. Utilice una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas.
   cautela: Este paso requiere la extracción gradual de la punta de la pipeta durante el pipeteo para evitar un desplazamiento excesivo del volumen.
4. Coloque las muestras en una centrífuga de cubo oscilante, centrifuga durante 20 minutos a 3.500 x g a 4 °C con el freno apagado.
5. Retire suavemente las muestras sin agitar y observe bajo la luz. Una banda blanca clara de núcleos con una pureza del 95% debe ser visible entre la segunda y la tercera capa (Figura 1).

>2. Aislamiento de núcleos

1. Aspire las capas superiores hasta que los núcleos blancos se agrupen en la interfase de 29% a 35%.
2. Recoja la banda de núcleos en un volumen de 200 mL, transfiérala a un tubo nuevo y filtre con un filtro de 20 μm (Tabla de Materiales).
   nota: Los núcleos no necesitan ser resuspendidos antes de la filtración.
3. Revise bajo un microscopio óptico para verificar la remoción de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe estar distorsionada.
4. Cuente los núcleos mediante tinción con azul de tripán en un hemocitómetro y los núcleos alícuotas para snRNA-seq/snATAC-seq.

Tabla 1: Preparación de una mezcla maestra estable de tampón de homogeneización 6x

6x Tampón de homogeneización Mezcla maestra estable
Reactivo	Conc. Final	Vol para 100 (mL)
1 M CaCl₂	30 mM	3.0
1 M mg(Ac)₂	18 mM	1.8
1 M Tris pH 7.8	60 mM	6.0
H₂O		Artículo 89.2
Mantener a temperatura ambiente, evitar la exposición directa a la luz

Tabla 2: Preparación de 1 M de sacarosa

1 M de sacarosa

34,23 g de sacarosa

Disolver en 78,5 mL de agua

Llene hasta 100 ml con agua

Tabla 3: Preparación de 6 veces la solución inestable del tampón de homogeneización (650 μL por muestra)

6x Tampón de Homogeneización Solución Inestable (650 mL por muestra)
Reactivo	Conc. Final	Vol por muestra (μL)
6x Tampón de homogeneización estable	6 veces	648.84
100 mM PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)	0,1 mM	1.08
14,3 M β-mercaptoetanol	1 mM	0.08

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo para el aislamiento de núcleos. El diagrama de flujo proporciona una breve descripción de los pasos involucrados en el aislamiento de núcleos individuales de un tejido de glioma fresco congelado. Se muestran imágenes representativas de la muestra tumoral y la banda nuclear después del gradiente de yodixanol/sacarosa (encerrada en un círculo con una línea de puntos roja).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
EDTA (0,5 M)	Termo Científico	R1021
Centrífuga cónica Falcon 15 mL Tubos	Fisher Científico	352096
Iodixanol (también conocido como Optiprep)	Tecnologías de células madre	07820
NP-40	Abcam	AB142227
Tubos de bloqueo seguro de 1,5 mL	Eppendorf	0030120086
Tubos de bloqueo seguro 2.0 mL	Eppendorf	0030120094
sacarosa	sigma	S0389
Puntas de pipeta de diámetro ancho (1000 μL)	Themo Fisher Científico	2079GPK
Puntas de pipeta de diámetro ancho (200 μL)	Themo Fisher Científico	2069GPK