Seccionamiento de tejido cerebral de ratón congelado: un procedimiento para obtener secciones delgadas de tejido cerebral congelado a partir de tejido cerebral murino congelado

Resumen

Fuente: Comba, A. et al. Microdisección de captura láser de subregiones de glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, oncostreams e invasión. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos la sección de un tejido tumoral cerebral de ratón congelado utilizando un criostato. Las secciones de tejido cerebral congelado así obtenidas se almacenan a bajas temperaturas hasta su posterior análisis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Seccionamiento de tejidos de tumores cerebrales congelados

1. Etiquete los portaobjetos de naftalato de polietileno (PEN) de 2 μm con la información de la muestra. Las secciones de tejido se colocarán directamente sobre estos portaobjetos después de la sección.
2. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato entre -20 y -24 °C. Antes de seccionar, coloque el bloque de muestra en la cámara de criostato y deje que se equilibre a la temperatura de la cámara durante 30 a 60 minutos.
3. Limpie la cámara de criostato y el portacuchillas con etanol al 100% y rocíe los cepillos a utilizar con solución limpiadora de RNase. Trabajando dentro de la cámara de criostato, retire el molde y fije el bloque de OCT que contiene el cerebro al disco de muestra de criostato con OCT. Coloque el bloque en el soporte del disco y alinee el bloque con la hoja del cuchillo.
4. Instale una cuchilla desechable en el soporte de seccionamiento.
5. Seccione el cerebro a 10 μm de grosor. Asegúrese de que no haya rayas ni líneas de arañazos en el pañuelo. Con un pincel, aplana y desenrolla con cuidado el pañuelo sobre la superficie de corte.
6. Monte con cuidado el tejido que contiene las secciones del cerebro en portaobjetos de vidrio PEN sin RNasa. Voltee los portaobjetos de vidrio cargados positivamente con los dedos en dirección al pañuelo y presione suavemente el portaobjetos de vidrio hacia la sección del tejido.
   nota: La temperatura de las manos ayudará a que el tejido se adhiera al vidrio.
7. Después de montar las secciones de cerebro en los portaobjetos, guarde los portaobjetos en una caja dentro de la cámara de criostato y luego guárdelos a -80 °C. Nunca mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente.
   nota: El plegamiento del tejido y el desgarro son comunes. Para un análisis posterior preciso, es importante minimizar estos artefactos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de vidrio de membrana PEN (2 μm)	Lieca	1150518
Criostato de investigación	Leica	CM3050s
Solución de descontaminación de RNasa RNaseZap	Fisher Científico	AM9780
Despegue los moldes de inclusión desechables	Ciencias de la Microscopía Electrónica	70182
Solución precisa	Investigación de Zymo	D3001-1
Compuesto Tissue-Plus O.C.T.	Fisher Científico	23-730-571