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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Fijación y tinción de secciones de tejido cerebral criopreservadas
- Para preservar la integridad del ARN, limpie todos los instrumentos que se vayan a utilizar con la solución de limpieza de ARNasa. Proceda con el protocolo de fijación y tinción dentro de una campana extractora.
- Prepare las soluciones fijadoras descritas en tubos limpios de 50 mL libres de RNasa. Prepare todas las soluciones con agua libre de RNasa el día de la tinción.
- El mismo día se realizará la microdisección láser, se prepararán soluciones de etanol al 100%, 95%, 70% y 50%. Mantenga las soluciones en tubos herméticamente cerrados a temperatura ambiente.
- Prepare un 4% de violeta de cresilo y un 0,5% de eosina Y en una solución de etanol al 75%. Agite la solución vigorosamente durante 1 minuto y fíltrela a través de un filtro de nailon de 0,45 μm para eliminar los restos de polvo no disuelto.
- Coloque los portaobjetos de papel en un recipiente con etanol al 95% durante 30 s. Transfiera los portaobjetos al tubo que contiene etanol al 75%; deje los portaobjetos allí durante 30 s.
- Transfiera los portaobjetos a etanol al 50% y déjelos allí durante 25 s. En este punto, los PTU se disolverán. Transfiera el portaobjetos a una solución de violeta de Cresilo al 4% durante 20 s y luego transfiéralo a una solución de eosina Y al 0,5% durante 5 s.
- Saca el portaobjetos de la solución de tinte y sécalo con un papel de filtro. A continuación, coloque los portaobjetos en etanol al 50% durante 25 s. Transfiera los portaobjetos a etanol al 75% durante 25 s. Transfiera los portaobjetos a etanol al 95% durante 30 s. Transfiera los portaobjetos a etanol al 100% durante 60 s.
- Enjuague el portaobjetos con xileno. Transfiérelos a un recipiente con xileno y espera 3 min.
- Prepare el medio de montaje (por ejemplo, goma Pinpoint) en agua libre de ARNasa. Para montar secciones de cerebro de ratón, diluya el medio de montaje en agua libre de ARNasa en una proporción de 1:10.
- Seque los portaobjetos sobre una superficie libre de RNasa a temperatura ambiente durante 10 s. Antes de que el xileno se seque, proceda a montar los portaobjetos con las secciones de tejido.
- Disperse suavemente la solución de montaje sobre el tejido en el portaobjetos con un pincel fino estéril y sin RNasa. Espere de 10 a 20 s y luego transfiera inmediatamente los portaobjetos de tejido a la plataforma de microdisección del microscopio.
NOTA: La relación entre el medio de montaje y el agua libre de RNasa utilizada para el montaje varía según el tejido de interés. La relación medio/agua de montaje preserva la morfología del tejido del glioma para la microdisección con láser sin afectar la integridad del ARN.