Extracción basada en inmunoafinidad de péptidos ubiquitinilados: una técnica para extraer selectivamente péptidos marcados con ubiquitina a partir de fracciones de péptidos purificados

Resumen

Fuente: Bezstarosti, K. et al. Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas mediante enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un método para extraer y purificar péptidos ubiquitinilados que contienen péptidos di-glicina remanentes de una mezcla compleja de péptidos. El método presentado puede ayudar a identificar los sitios originales de ubiquitinación en la proteína.

Protocolo

1. Extracción de péptidos ubiquitinilados

1. Utilice cromatografía C18 de fase reversa (RP) de pH alto con material polimérico en fase estacionaria (300 Å, 50 μM; consulte la tabla de materiales) cargado en un cartucho de columna vacía para fraccionar los péptidos trípticos. El tamaño del lecho de fase estacionaria debe ajustarse a la cantidad de proteína que se va a fraccionar. Prepare un cartucho de columna vacío de 6 ml (consulte la tabla de materiales) lleno con 0,5 g de material de fase estacionaria para ~ 10 mg de digestión de proteínas. La relación entre la digestión de proteínas y la fase estacionaria debe ser de aproximadamente 1:50 (p/p).
2. Cargue los péptidos en la columna preparada y lave la columna con aproximadamente 10 volúmenes de columna de 0,1% de TFA, seguidos de aproximadamente 10 volúmenes de columna de H2O.
3. Eluir los péptidos en tres fracciones con volúmenes de 10 columnas de solución de formiato de amonio 10 mM (pH = 10) con acetonitrilo (AcN) al 7%, 13,5% y 50%, respectivamente. Liofilizar todas las fracciones hasta completarlas.
4. Utilice anticuerpos con motivo remanente de ubiquitina (K-ε-GG) conjugados con perlas de agarosa de proteína A para el inmunoenriquecimiento de péptidos diGly. Debido a que la cantidad exacta de anticuerpos por lote de perlas es información patentada y no divulgada por el fabricante, se recomienda usar la misma definición para un lote de perlas que el fabricante para evitar confusiones. Lave un lote de estas cuentas 2 veces con PBS y divida la suspensión de cuentas en seis fracciones iguales. Véase la Figura 1 para un esquema experimental detallado.
5. Disuelva las tres fracciones peptídicas recogidas en el paso 1.3 en 1,4 mL de un tampón compuesto por 50 mM de MOPS, 10 mM de fosfato de sodio y 50 mM de NaCl (pH = 7,2), y centrifuga los residuos.
6. Añadir los sobrenadantes de las fracciones a las perlas de anticuerpos diGly e incubar durante 2 h a 4 °C en una unidad de rotación. Gire las perlas y transfiera el sobrenadante a un nuevo lote de perlas de anticuerpos y vuelva a incubar durante 2 h a 4 °C.
7. Almacene los sobrenadantes para el posterior análisis del proteoma global (GP).
8. Transfiera las perlas de cada fracción a una punta de pipeta de 200 μL equipada con un tapón de filtro GF/F para retener las perlas. Coloque la punta de la pipeta con las perlas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml equipado con un adaptador de punta de centrífuga. Lave las perlas 3 veces con 200 μL de tampón IAP helado y posteriormente 3 veces con 200 μL de Milli-Q H₂O. Gire la columna a 200 x g durante 2 minutos antes de cada paso de lavado, pero tenga cuidado de no dejar que la columna se seque. Eluir los péptidos utilizando 2 ciclos de 50 μL de AGT al 0,15%.
9. Desala los péptidos con una punta de etapa C18 (esencialmente una punta de pipeta de 200 μL con dos discos C18) y séquelos hasta completarlos mediante centrifugación al vacío.

Resultados

Figura 1: Resumen experimental.(A) Visión general del enfoque experimental. Las muestras se prepararon, tripsinizaron y fraccionaron en tres fracciones mediante cromatografía de fase reversa con elución de pH alto. Un lote de perlas comerciales de anticuerpos de péptidos α-diGly se dividió en seis fracciones iguales y las tres fracciones peptídicas se cargaron en tres de las fracciones de perlas. Los péptidos diGly se inmunopurificaron,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lisil endopeptidasa (LysC)	Productos químicos puros de Wako	129-02541
Horno NanoLC	Diseño MPI, MS Wil GmbH
Sal sódica de N-lauroilsarcosina	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass espectrómetro	ThermoFisher
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polimérico Partículas de fase reversa	Tecnologías Agilent	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Botiquín	Tecnologías de señalización celular	5562
Cartucho Sep-Pak tC18 6 cc Vac	aguas	WAT036790	Retire el material tC18 del cartucho antes de llenar el cartucho con PLRP-S
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsina, tratada con TPCK	ThermoFisher	20233