Ensayo de síntesis de ADN: una técnica para evaluar la síntesis de ADN en células en proliferación mediante la incorporación de timidina tritiada radiactiva

Resumen

Fuente: Williams, M. et al. Detección rápida de fenotipos del neurodesarrollo en células precursoras neurales humanas (NPCs). J. Vis. Exp. (2018)

En este video, determinamos la capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales midiendo la incorporación de timidina tritiada trazadora radiactiva en el ADN de las células. Esta técnica se puede utilizar para estudiar la proliferación celular después del tratamiento con ciertos fármacos y factores de crecimiento.

Protocolo

1. Mantenimiento de NPCs

1. Coloque NPC con una densidad de 1,5 millones de células en un pocillo recubierto de gel que imita a ECM y que contiene 2 ml de medios de expansión al 100%.
2. Incuba los NPC a 37 °C en un ambiente húmedo con 5% de CO₂.
3. Añada 5 μM de inhibidor de ROCK al medio para las NPC con P3 o inferior, o para las NPC descongeladas, para evitar la muerte celular excesiva. Cambie el medio después de 24 horas para eliminar el inhibidor de ROCK.
4. Pasa las células cada 4 a 9 días, dependiendo de cuándo se vuelvan confluentes. Las células se consideran confluentes cuando se convierten en una monocapa densamente empaquetada que cubre todo el fondo de la superficie de la placa.
5. Placa NPCs a una densidad de 1 a 1,5 millones de células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Retire los medios gastados cada 48 h y reemplácelos con 2 ml de medios de expansión al 100%.

>3. Ensayo de síntesis de ADN de células precursoras neurales

1. Coloque 100.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos y evalúe por triplicado/condición.
2. Añadir [³H]-timidina tritiada radiactiva al medio de cultivo (1,5 μCi/mL) en cada pocillo después de 46 h de cultivo. Incubar las células a 37 °C durante 2 h.
   nota: Cuando utilice materiales radiactivos, reciba capacitación de su institución, siga los protocolos de seguridad contra la radiactividad y deseche los materiales radiactivos en los recipientes de desechos debidamente designados.
3. Retire y deseche adecuadamente los medios radiactivos después de 2 h. Agregue 300 μL de tripsina-EDTA precalentado al 0,25% (0,5 mM) a cada pocillo e incube durante 20 min a 37 °C.
4. Encienda el recolector de celdas (consulte la sección Materiales) y la bomba y asegúrese de que la presión de la bomba esté por debajo de 200 PSI. Coloque el papel de filtro a través del espacio en el recolector de celdas y corte la esquina derecha para marcar la orientación del papel.
5. Coloque los tubos colectores de la cosechadora de células en una bandeja vacía "en blanco" y presione el prelavado para humedecer el papel de filtro. Coloque los tubos colectores en los pocillos de muestra y páselos (arranque).
6. Cuando el recolector de células haya terminado de recolectar muestras, levante la abrazadera y avance el papel de filtro para repetir para todos los juegos de muestras. Siempre prelave en una placa vacía y "en blanco".
7. Seque el papel de filtro bajo una fuente de luz y coloque los viales correspondientes en una bandeja. Perfore los trozos de papel en viales y agregue 2 ml de cóctel de centelleo líquido a cada vial. Tape y etiquete los viales.
8. Incubar los viales en un cóctel de centelleo líquido durante al menos 1 h antes de leer los recuentos por minuto (CPM) en una máquina de centelleo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12 Medio Avanzado	ThermoFischer Científico	12634-010	Componente del medio de expansión 100%
Medio Neurobasal	ThermoFischer Científico	21103049
Placas de 24 pocillos	ThermoFischer Científico	2021-05	Placas de poliestireno: se utilizan para el ensayo de síntesis de ADN NPC
Laminina de ratón natural	Invitrogen	23017-015	Sustrato para placas de recubrimiento: Se utiliza para la síntesis de ADN NPC, la entrada en fase S y los ensayos de número de células
Penicilina/Estreptomicina	ThermoFischer Científico	15140122	Antibiótico, componente en los medios de expansión
2.5% Tripsina (10X)	Gibco	15090-046	Solución enzimática 10X
0,5 M EDTA	ThermoFischer Científico	AM9261	Se utiliza en solución de tripsina para levantar células para el ensayo de síntesis de ADN
tritiada [3H]-timidina	PerkinElmer	NET027E001	Tritio radiactivo, timidina
Viales de centelleo de HDPE de 7 mL de Fisherbrand	Marca Pescadora	03-337-1	Viales para el recuento de centelleo líquido
EcoLite(+)	MP Biomedicals	188247501	Cóctel líquido de centelleo
LS 6500 contador de centelleo líquido multiusos	Beckman Coulter	8043-30-1194	Contador de centelleo líquido
Cosechadora de células semiautomáticas Skatron	Dispositivos Moleculares y Skatron Instruments, Inc.	Tipo 11019	Cosechadora de células semiautomática
Papel de filtro de grado GF/C, Whatman	GE Healthcare Ciencias de la Vida	1822-849	Papel de filtro de fibra de vidrio