Ensayo de la neurosfera NPC: un ensayo in vitro para evaluar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera

Resumen

Fuente: Williams, M. et al. Detección rápida de fenotipos del neurodesarrollo en células precursoras neurales humanas (NPCs).J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra el ensayo de migración de la neurosfera de células precursoras neurales, un ensayo in vitro para estudiar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera, a través de un análisis microscópico.

Protocolo

1. Ensayo de migración de la neurosfera NPC

1. Formación de la neurosfera
   1. Agregue 1 mL de medio de expansión al 100% en un plato de 35 mm sin sustrato de recubrimiento. Incubar las placas durante al menos 15 minutos a 37 °C antes de colocar las placas NPC. Prepare 2 o 3 placas para asegurarse de que habrá suficientes neuroesferas para el ensayo de migración celular.
      nota: La ausencia de un sustrato de recubrimiento asegura que las NPC permanezcan suspendidas en el medio, lo cual es esencial para la formación de la neurosfera. Los platos de recubrimiento evitarán la formación de neurosferas.
   2. Levanta, disocia y granula las células. Vuelva a suspender el pellet celular en 2-5 mL de medio de expansión 100% precalentado. Coloque 1 millón de PNJ en cada plato de 35 mm preparado en la sección 1.1.1.
   3. Incuba los PNJ a 37 °C durante 48 a 96 h para permitir que los PNJ se agreguen y formen neuroesferas. Evalúe el tamaño de la esfera utilizando una regla viva en un microscopio de contraste de fase. Espere a que la mayoría de las esferas alcancen un diámetro aproximado de 100 μm (± 20 μm) (Figura 1). Las esferas más pequeñas se dispersarán y romperán por completo durante el ensayo de migración.
2. Preparación de placas para el ensayo de migración de la neurosfera
   1. Disuelva las alícuotas de gel que imitan a ECM en 6 ml de medios de expansión al 30%. Una vez preparada la solución de gel ECM-mimic/30% de medios de expansión, agregue vehículos, factores de crecimiento o medicamentos de interés a las concentraciones deseadas.
      nota: Es necesario aumentar las concentraciones de vehículos, fármacos y factores de crecimiento para tener en cuenta la adición de 200 μL de neuroesferas en la sección 1.3.
   2. Coloque 1 mL de la solución de gel ECM-mimic / 30% de medios de expansión (± vehículos, factores de crecimiento o medicamentos) en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Haz de 2 a 3 pozos por condición experimental. Alternativamente, se pueden utilizar platos de 35 mm. Incubar las placas durante al menos 30 min a 37 °C^.
      nota: NO aspire la solución de gel ECM-mimic/medio de expansión al 30% para este ensayo. La colocación de esferas en un gel ECM-Mimic aspirado provocará una migración rápida y excesiva.
3. Enchapado de neuroesferas
   1. Recoja las neuroesferas formadas en la sección 1.1 y colóquelas en un tubo cónico. Lave los platos de 35 mm con 1 ml de 1x PBS para asegurarse de que se recogen todas las neurosferas. Gire las neuroesferas recolectadas a 100 x g durante 5 minutos.
   2. Vuelva a suspender las neuroesferas en 1-3 ml de medio de expansión precalentado al 30%. Si se recolecta 1 placa de neurosferas, se usa 1 mL de medio para resuspender las esferas. Si se recogen 2 platos, se añaden 2 ml de medio para resuspender las esferas, etc. Pipetear suavemente y utilizar sólo un P-1000 para asegurarse de que las esferas no se rompan.
   3. Placa de 200 μL de las neuroesferas resuspendidas en la solución de gel ECM-mimic/expansión al 30% realizada en la sección 1.2. Placas de roca en todas las direcciones para distribuir uniformemente las neurosferas. Incubar las placas durante 48 h a 37°C.
   4. Retire la solución de gel ECM-mimic/medio de expansión al 30 % y fije las células en PFA al 4 %, lave y mantenga las células en 1x PBS + azida de sodio al 0,05 %.
4. Análisis de las neuroesferas
   1. Adquiera imágenes de neuroesferas enteras utilizando los ajustes de contraste de fase a 10X. Asegúrese de que las esferas no se toquen entre sí. Mida la migración promedio utilizando el software ImageJ.
   2. Traza el contorno exterior de la neurosfera con la herramienta de línea a mano alzada. Se puede acceder a la línea a mano alzada haciendo clic con el botón derecho en el icono de la línea "recta". Rastreo manual con un ratón.
   3. Utilice la función de medición para calcular el área de la traza. Asegúrese de que "área" esté seleccionada como lectura en la ventana "Establecer mediciones" que se encuentra en la pestaña Analizar. Consulte la Figura 2 para ver el trazo del contorno exterior en azul.
   4. Traza la masa celular interna de la esfera y mide el área. Consulte la Figura 2 para ver el trazo del contorno interno en rojo. Cuantifique la migración promedio restando la masa celular interna del área total de la neurosfera.
   5. Mida las neuroesferas que exhiben una masa celular interna densamente empaquetada con células que migran hacia afuera como una alfombra contigua (Figura 2).
   6. No incluya células fuera de la alfombra o separadas de la neurosfera para la medición. Consulte la Figura 2 para ver ejemplos de celdas (marcadas con un círculo blanco) que se excluyen de la medición de la alfombra exterior. Analizar un mínimo de 20 neurosferas para cada condición.

Resultados

Figura 1: Selección de neurosferas para el ensayo de migración. (A) Imagen de contraste de fase de un campo representativo de neuroesferas a las 24 h. Todas las esferas tienen menos de 100 μm y, por lo tanto, no se recogen para el ensayo de migración. (B) Imagen de contraste de fase de un campo representativo de neurosferas a las 72 h. Todas las esferas están dentro del rango de 100 μm ± 20 μm, lo que i...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Neurobasal	ThermoFischer Científico	21103049	Componente de NIM y medio de expansión al 100%
Medio de inducción neuronal PSC: Enlace de protocolo: https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer Científico	A1647801	Se trata de un kit que consta de medio Neurobasal (NB) y un Suplemento de Inducción Neural (NIS) 50x. El NIS se utiliza para fabricar un medio de inducción neuronal 1X y un medio de expansión del 100%
DMEM/F12 Medio Avanzado	ThermoFischer Científico	12634-010	Componente del medio de expansión 100%
Matrigel con certificación hESC	Corning	354277	Gel de imitación de matriz extracelular calificado por hESC (gel de imitación de ECM)
Placas de 6 pocillos	Corning	COR-3506	Placas de poliestireno utilizadas para el mantenimiento de NPC y para el ensayo de migración de la neurosfera
Humano Básico FGF-2	Peprotech	100-18B	Factor de crecimiento
Penicilina/Estreptomicina	ThermoFischer Científico	15140122	Antibiótico, componente de NIM, 100% de expansión y 30% de expansión