Aislamiento de astrocitos: un método para obtener la preparación pura de astrocitos corticales de ratón

Resumen

Fuente: Schildge, S. et al. Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratón. J. Vis. Exp. (2013)

En este video, describimos el método para obtener una preparación pura de astrocitos de ratones recién nacidos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento y recubrimiento de células corticales mixtas

El aislamiento de células corticales mixtas para cultivos de astrocitos se puede realizar utilizando crías de ratón P1 a P4. Para lograr una densidad adecuada de astrocitos es necesario utilizar 4 cortezas de crías de ratón por matraz de cultivo de tejidos T75. Por lo tanto, los volúmenes del siguiente protocolo se calculan para la preparación de una célula utilizando 4 crías de ratón.

1. Antes de iniciar el procedimiento de disección, precalentar 30 mL de medio de cultivo de astrocitos (DMEM, glucosa alta + 10% de suero fetal bovino inactivado por calor + 1% de penicilina/estreptomicina; ver tabla) a 37 °C. Cubrir un matraz T75 con 20 mL de poli-D-lisina (PDL) a una concentración de 50 μg/mL en agua de grado de cultivo celular durante 1 hora a 37 °C en la incubadora de CO₂.
2. Para el procedimiento de disección, prepare todos los reactivos y materiales necesarios. Necesitará tijeras quirúrgicas, pinzas finas lisas, pinzas de punta plana, toallas de papel, una bolsa de desechos, etanol al 70% y 2 platos de disección (3,5 cm de diámetro) en hielo llenos de 2 ml de HBSS cada uno.
3. Sostenga suavemente y rocíe la cabeza y el cuello del cachorro de ratón con etanol al 70%. El animal es sacrificado por decapitación con tijeras.
4. Realice una incisión en la línea media, posterior a anterior, a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo.
5. Corta el cráneo con cuidado desde el cuello hasta la nariz. Se realizan dos cortes adicionales para permitir un mayor acceso al cerebro: el primer corte se hace anterior a los bulbos olfatorios, el otro inferior del cerebelo para desconectar el cráneo de la base del cráneo.
6. Con las pinzas de punta plana, los colgajos craneales se voltean suavemente hacia un lado y se extrae el cerebro y se coloca en la primera placa de disección llena de HBSS. Vuelva a colocar el plato en hielo y continúe cosechando los 4 cerebros.
7. El resto del procedimiento de disección se realiza bajo un microscopio estereoscópico. En primer lugar, se extraen los bulbos olfativos y el cerebelo con las pinzas de disección fina (Figura 1B).
8. Para recuperar las cortezas, agarre el extremo posterior del cerebro con las pinzas finas, realice una incisión en la línea media entre los hemisferios, inserte un segundo juego de pinzas en la ranura creada y retire la estructura en forma de placa de la corteza del cerebro.
9. Diseccionar cuidadosamente las meninges de los hemisferios de la corteza tirando con las pinzas finas (Figura 1D'). Este paso evita la contaminación del cultivo final de astrocitos por células meníngeas y fibroblastos. Transfiera los hemisferios de la corteza preparados al segundo plato lleno de HBSS y devuélvalo al hielo. Continúe en consecuencia con las 4 cortezas.
10. Finalmente, corte cada hemisferio de la corteza en pedazos pequeños con cuchillas afiladas (aproximadamente de 4 a 8 veces).
11. En condiciones estériles, transfiera las piezas de corteza a un tubo Falcon de 50 mL y agregue HBSS hasta un volumen total de 22.5 mL.
12. Añadir 2,5 mL de tripsina al 2,5 %, mezclar e incubar el tejido en el baño maría a 37 °C durante 30 min. Mezclar agitando ocasionalmente cada 10 min.
13. Centrifugar durante 5 min a 300 x g para pellet trozos de tejido de la corteza.
14. Retire con cuidado el sobrenadante por decantación. Para evitar la pérdida de la pastilla de tejido, puede retenerla mecánicamente con una pipeta. Disocie el tejido en una suspensión de una sola célula mediante la adición de 10 mL de medio de siembra de astrocitos y un pipeteo vigoroso con una pipeta de plástico de 10 mL hasta que las piezas de tejido se disocien en células individuales (20 a 30 veces). Ajuste el volumen a 20 mL utilizando un medio de siembra de astrocitos. Se puede probar la disociación del tejido de la corteza en células individuales contando con un hematocitómetro. Una preparación de 4 cortezas de cachorros de ratón debe producir de 10 a 15 x 10⁶ células individuales disociadas.
15. Aspirar PDL del matraz de cultivo T75, colocar la suspensión unicelular disociada e incubar a 37 °C en la incubadora de CO₂.

>2. Obtención de un cultivo de astrocitos enriquecido

1. Cambie el medio 2 días después de la siembra de las células corticales mixtas y los 3 días siguientes.
2. Después de 7 a 8 días, cuando los astrocitos son confluentes y la microglía superpuesta se encuentra expuesta en la capa de astrocitos o ya está separada de la capa de astrocitos (Figura 2), agite el matraz T75 a 180 rpm durante 30 min en un agitador orbital para eliminar la microglía. Deseche el sobrenadante que contiene microglía o, si desea cultivar y examinar la microglía, gírelo y coloque en una placa para el cultivo.
3. Agregue 20 mL de medio de cultivo de astrocitos frescos y continúe agitando el matraz a 240 rpm durante 6 horas para eliminar las células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Dado que algunas OPC no se desprenderán completamente de la capa de astrocitos, continúe agitando vigorosamente con la mano durante 1 minuto para evitar la contaminación por OPC. Deseche el sobrenadante o gírelo hacia abajo y colóquelo, si desea cultivar OPC.
4. Enjuague la capa de astrocitos confluente restante dos veces con PBS, aspire el PBS, agregue 5 mL de tripsina-EDTA e incube en la incubadora de CO₂ a 37 °C. Verifique el desprendimiento de astrocitos cada 5 minutos y fuerce el desprendimiento de astrocitos golpeando el matraz contra la palma de su mano (2-3 veces).
5. Después de separar los astrocitos del matraz de cultivo, agregue 5 mL de medio de cultivo de astrocitos, centrifugar las células a 180 x g durante 5 min, aspire el sobrenadante y agregue 40 mL de medio de siembra de astrocitos frescos. Un matraz de cultivo de tejidos T75 debería producir alrededor de 1x10⁶ células después de la primera división de células. Colocar las células en placa en dos matraces de cultivo T75 e incubar a 37 °C en la incubadora de CO₂. Cambie el medio cada 2 o 3 días.
6. 12-14 días después de la primera división, los astrocitos se siembran en la concentración celular adecuada 24-48 horas antes de realizar el experimento. Un matraz de cultivo de tejidos T75 debería producir alrededor de 1,5-2 x10⁶ células después de la segunda división de células.

Resultados

Figura 1. Disección de la corteza postnatal (P3) del ratón. A) Todo el cerebro. B) Cerebro después de la extracción de bulbos olfativos y cerebelo. C) Aislamiento de las cortezas mediante el desprendimiento de la estructura en forma de placa de la corteza del cerebro. D, D') Corteza ventral y dorsal con meninges (las flechas negras indican arterias meníngeas). E) Corteza sin meninges. ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios de cultivo de astrocitos
DMEM glucosa alta	Tecnologías de la Vida	31966-021
FBS inactivado por calor	Tecnologías de la Vida	10082-147	Concentración final: 10%
Penicilina-Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122	Concentración final: 1%
Solución para la digestión del tejido cerebral
HBSS	Tecnologías de la Vida	14170-088
2.5% Tripsina	Tecnologías de la Vida	15090-046	Concentración final: 0.25%
Otro
70% (vol/vol) de etanol	Roth	9065.2
Poli-D-lisina	Millipor A-003	A-003-S
Agua	PAA	S15-012	Grado de cultivo celular
Pbs	PAA	H15-002	Grado de cultivo celular
0,05% Tripsina-EDTA	Tecnologías de la Vida	25300-062
Filtro estéril de 0,45 μm	sartorio	16555
Placa de Petri de 3,5 cm	Halcón BD	353001
Tubo Falcon de 15 ml	Halcón BD	352096
Tubo Falcon de 50 ml	Halcón BD	352070
Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2	Halcón BD	353136
Pinzas finas	Dumont	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Pinzas de punta plana	KLS Martín	12-120-11
Tijeras quirúrgicas de 13 cm	Esculapio	BC-140-R
Microscopio estereoscópico	Leica		MZ7.5
Microscopio estereoscópico + Cámara	Leica		MZ16F; DFC320
Microscopio + Cámara	Zeiss; Canónigo		Primo Vert; PowerShot A650 IS
centrífuga	Eppendorf	5805000.017	centrífuga5804R
Agitador orbital	Termo Científico	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Baño de agua	Julabo		SW20; 37 °C