Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de microvasos cerebrales de rata
- Para cada preparación y para un experimentador, use 3 ratas Wistar de cinco semanas de edad.
- El lunes de la primera semana, preparar 2 matraces T75 recubriendo con colágeno tipo IV y fibronectina, ambos a 1 μg/cm2 en agua de cultivo estéril (10 ml por T75). Dejar adherir a 37 °C hasta la siembra de los microvasos.
- El miércoles por la mañana de la primera semana, se sacrificó a las ratas bajo un flujo creciente de CO2 para inducir somnolencia, pérdida de postura e interrupción de la respiración, seguida de dislocación cervical. Rocíe las cabezas con etanol al 70%. Corte las cabezas con un par de tijeras y transfiéralas a una placa de Petri seca debajo de una campana de flujo laminar.
- Extraiga los cerebros del cráneo sin el cerebelo y los nervios ópticos, luego transfiéralos a una placa de Petri enfriada en hielo y llena de tampón de disección fría (HBSS suplementado con BSA al 1%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 μg/ml).
- Corta los cerebros por la mitad para separar los 2 hemisferios cerebrales y separa el mesencéfalo del prosencéfalo. Transfiera los prosencéfalos a una placa de Petri limpia sobre hielo con tampón de disección.
- Tome un par de hemisferios en una nueva placa de Petri con tampón de disección fría para extraer cuidadosamente las meninges de los prosencéfalos bajo un microscopio estereoscópico con pinzas curvas N° 5. A continuación, se limpia el interior del cerebro para retirar el edredón de mielina y obtener una cáscara de corteza. Estos pasos no deben tomar más de 2 horas para la preservación del tejido y la supervivencia celular.
- Disocie la corteza de 3 cerebros en 6 mL de tampón de disección fría en un homogeneizador de onzas de 7 mL mediante 10 golpes hacia arriba y hacia abajo con cada uno de 2 morteros de diferentes aclaraciones, 71 μm seguidos de 20 μm.
- Divida la suspensión para obtener el equivalente de 1 corteza en 1 mL de un tubo Falcon de 50 mL y centrifugue a 1,000 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
- Digiera la suspensión de 1 corteza con 1 mL de una solución enzimática que contenga una mezcla de colagenasas/dispasa (60 μg/mL–0,3 U/mL), DNasa tipo I (35 μg/mL–20 K unidades/mL) y gentamicina (50 μg/mL) en un agitador durante 30 min a 37 °C.
- Mezclar 1 mL de digestión de 1 corteza con 10 mL de 25 % BSA/HBSS 1X y separar por centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 x g durante 15 min a RT. Transfiera cuidadosamente el disco superior (mielina y parénquima cerebral) y el sobrenadante a un tubo Falcon limpio de 50 mL y repita la centrifugación. Mantenga el gránulo resultante que contiene los microvasos cerebrales a 4 °C.
- Deseche con cuidado el disco superior y el sobrenadante. Vuelva a suspender los dos gránulos resultantes que contienen los microvasos cerebrales con 1 mL de HBSS 1X frío y transfiéralos a un tubo Falcon limpio de 50 mL.
- Lavar los microvasos con la adición de 20 mL de HBSS frío 1X y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Además, digiera los microvasos de 1 corteza con 1 mL de la misma solución enzimática como se describe en el paso 1.9 durante 1 hora a 37 °C en un agitador.
- A continuación, mezcle los microvasos digeridos de cada una de las 3 cortezas en un tubo y sepárelos en dos tubos Falcon de 50 ml para obtener microvasos extraídos del equivalente a una corteza y media (1,5) por tubo. Añadir 30 mL de tampón de disección en frío y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a RT.
- Resuspender el pellet del microvaso en 10 mL de DMEM/F12 suplementado con un 20% de suero derivado de plasma pobre en plaquetas bovinas, factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF, 2 ng/mL), heparina (100 μg/mL), gentamicina (50 μg/mL) y HEPES (2,5 mM), denominados medios de células endoteliales (MEC) suplementados con puromicina a 4 μg/mL.
- Tome los 2 matraces T75 recubiertos de la incubadora, aspire el exceso de recubrimiento y coloque los microvasos de cada tubo en un matraz T75 (microvasos extraídos de 1,5 cortezas por matraz T75).
