Barrera hematoencefálica o modelo BBTB: una adaptación del modelo de barrera hematoencefálica o BBB para evaluar la administración de tratamientos al tumor

Resumen

Fuente: Le Joncour, V. et al. Predicción de la entrega de cargas útiles in vivo utilizando una barrera tumoral hematoencefálica en una placa. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, describimos un protocolo integral para establecer un modelo in vitro que imita la barrera hematoencefálica. El modelo es prometedor para comprender la administración de agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores cerebrales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Establecimiento de los imitadores de BBTB

NOTA: El medio de cultivo celular y los suplementos se detallan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de Astrocitos
   nota: Los siguientes volúmenes son adecuados para una placa de Petri de 10 cm o un matraz de cultivo celular T75.
   1. Bajo una cubierta de cultivo celular estéril, lavar cuidadosamente los astrocitos cultivados con 5 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Deseche suavemente el PBS con una bomba de vacío y agregue 2 mL del reactivo de disociación celular durante 5 min (a 37 °C, consulte la Tabla de materiales) para separar las celdas. Verifique el desprendimiento de células bajo el microscopio. No exceda los 5 minutos de incubación para limitar el estrés en las células.
   2. Añada 10 mL de medio de cultivo de células de astrocitos completo estéril (ABM+) al vaso para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células desprendidas del vaso a un tubo estéril de 15 ml. Centrifugar la suspensión de la célula durante 3 min a 250 rcf (aceleración: 9 rcf/s, desaceleración: 5 rcf/s) a temperatura ambiente (RT).
   3. Mientras tanto, prepare los insertos (consulte la Tabla de materiales): Con pinzas estériles, coloque los insertos con el cerebro hacia arriba (Figura 1A) en la tapa de una placa estéril de 6 pocillos (Figura 1B). Verifique de antemano que la placa se pueda colocar boca abajo sobre los insertos sin tocar ni mover los insertos durante el proceso.
      NOTA: La colocación adecuada de los insertos permite el atrapamiento de la suspensión de astrocitos entre la membrana y el fondo del pocillo.
   4. Una vez centrifugado, deseche cuidadosamente el sobrenadante de la suspensión celular; vuelva a suspender el pellet de astrocito en 1 mL de ABM+ resuspendiendo suavemente el pellet en la pared del tubo hasta 5 veces. Evite el pipeteo excesivo de las células para limitar el estrés en las células. Cuente las células y ajuste la densidad de suspensión de las células a 1,5 x 10⁵ células en 400 μL de ABM+/inserto.
   5. Coloque la suspensión celular en el centro del lado del cerebro de la membrana del inserto (Figura 1B) y, con mucho cuidado, extiéndala utilizando la fuerza capilar con una punta de pipeta estéril. Evite el contacto directo, ya que la membrana es particularmente frágil.
   6. Con el lado del cerebro de los insertos aún hacia arriba, vuelva a colocar la placa de 6 pocillos en los insertos. Esto asegura que la suspensión celular quede atrapada entre la membrana y el fondo real del pozo (Figura 1C). Evite las burbujas de aire en la suspensión celular, ya que evitará la propagación homogénea de los astrocitos en la membrana.
   7. Coloque la placa y los insertos, con el cerebro hacia arriba, en la incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂) para permitir la adhesión celular durante un mínimo de 2 h (astrocitos inmortalizados murinos) y hasta 6 h (astrocitos primarios humanos)
      NOTA: Como los insertos se mantienen al revés, la visualización de la adhesión celular no es posible bajo un microscopio. Por lo tanto, se recomienda sembrar un recipiente de cultivo celular regular separado y controlar la adhesión celular en el recipiente a lo largo del tiempo. La manipulación cuidadosa de la membrana es imprescindible, ya que los resultados no serán fiables cuando las membranas estén dañadas.
   8. Al final del tiempo de incubación, verifique la ausencia de fugas de suspensión celular fuera del área de siembra y deseche los insertos si tienen fugas. Revierta la placa de 6 pocillos a su posición normal, con insertos que ahora tendrán el lado de la sangre hacia arriba (Figura 1A). Agregue 2.6 mL de ABM+ a cada pocillo. Vierta 2,5 mL de medio astrocitario completo en cada inserto y coloque la placa en la incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂).

>2. Preparación de células endoteliales

NOTA: Para las células endoteliales microvasculares del cerebro murino (bEND3), las células deben alcanzar el 100% de confluencia para asegurar el máximo contacto célula-célula desencadenando la expresión óptima de la proteína de unión estrecha el día del experimento. Esto no se aplica a las células endoteliales de la vena umbilical humana (HuAR2T), ya que la presencia de astrocitos es necesaria para la expresión de proteínas de unión estrecha para estas células.

1. Proceda como se ha descrito anteriormente para los astrocitos para la disociación celular. Una vez centrifugado, deseche con cuidado el sobrenadante; resuspender el pellet de células endoteliales en 1 mL de medio de cultivo de células endoteliales completo (EBM+) pipeteando lentamente la suspensión celular en la pared del tubo hasta 5 veces. Evite el pipeteo excesivo de las células para limitar el estrés en las células. Cuente las células y ajuste la densidad de suspensión celular a 2 x 10⁵ células en 2,5 mL/inserto de medio de cultivo de células endoteliales desprovisto de suero (MBE-) y factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A).
2. Saque la placa que contiene los insertos, deseche con cuidado el medio del lado de la sangre y reemplácelo con 2,5 ml de la suspensión de células endoteliales. Regrese la placa a la incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂) y déjela toda la noche para que las células endoteliales se adhieran a la membrana.
3. Al día siguiente, prepare una placa estéril de 6 pocillos transfiriendo 3 mL de medio astrocitario libre de suero precalentado (ABM-) a cada pocillo. Al manipular los insertos con pinzas estériles, deseche cuidadosamente el medio endotelial completo del lado de la sangre, coloque el inserto en la nueva placa que contiene ABM-, y agregue 2,5 mL de EBM-.
   nota: El uso de la MBE- es crítico para el establecimiento de la barrera endotelial.
4. Deje los insertos en la incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂) con una perturbación física mínima y variaciones de temperatura durante 5 días, lo que permite la producción de la membrana basal endotelial, los contactos de los astrocitos con las células endoteliales y, finalmente, la formación mímica de BBTB. Reemplace el medio el día de la transferencia en cultivos de células de glioma.

>3. Preparación de las células de glioma

NOTA: Aunque aquí se utilizan esferas de glioblastoma derivadas del paciente, el siguiente protocolo se puede adaptar fácilmente para las células de glioblastoma adherentes disponibles comercialmente, como el U-87MG.

1. Opcionalmente, para la obtención de imágenes de inmunofluorescencia, se coloquen hasta cuatro cubreobjetos redondos estériles de borosilicato (ø 0,9 cm) por pocillo en una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de poli-D-lisina (0,01%). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Mientras tanto, transfiera cuidadosamente las esferas tumorales del recipiente de cultivo celular a un tubo estéril de 15 ml utilizando una pipeta serológica estéril. Centrifugar las esferas tumorales durante 3 min a 250 rcf.
3. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente las esferas en 1 ml de medio de células de glioma libre de bFGF/EGF (GBM-) y cuente las células. Ajuste la densidad de celdas a aproximadamente 10⁴ esferas/mL (10⁵ celdas/mL) en GBM-.
4. Deseche la poli-D-lisina de los pocillos y enjuáguelos 3 veces con PBS estéril. Siembre la placa con 3 mL/pocillo de la suspensión esferoide tumoral y transfiera los insertos con la imitación de BBB en la suspensión de células tumorales.
5. Incubar durante la noche (a 37 °C con 5% de CO₂) para permitir el equilibrio entre los lados de la sangre y el tumor cerebral del ensayo. Al día siguiente, reemplace los medios en el lado de la sangre con EBM- suplementado con las moléculas/fármacos/nanopartículas de interés. Las muestras se recogen a lo largo del tiempo para su cuantificación directa, como se describe en la sección anterior. Las células se fijan en un punto de tiempo preciso para la obtención de imágenes de fluorescencia.

Resultados

Figura 1: Descripción del modelo de barrera tumoral hematoencefálica (BBTB).(A) Representación esquemática de las ubicaciones de los diferentes tipos de células. (B) Ilustración de la colocación del inserto en la cubierta de la placa de 6 pocillos y la técnica de siembra para los astrocitos en el lado del cerebro de la membrana del inserto. (C) Ilustración de la colocación de la placa d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
células
bEND3	ATCC	CRL-2299	Cultivado en: DMEM (1 g/L de glucosa) suplementado con 10% de FBS- 5 mL de L-glutamina y 5 mL de penicilina/estreptomicina
HIFko inmortalizó astrocitos de ratón	Aislado en el laboratorio del Dr. Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Cultivado en: BME-1 suplementado con 5% de FBS- 5 mL 1 M HEPES-5 mL 100 mM de piruvato de sodio- 3 g de D-glucosa y 5 mL de penicilina/estreptomicina
HuAR2T	Aislado en el laboratorio del Dr. Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Cultivado en: EBM-2 con astrocitos primarios humanos normales SupplementMix Lonza CC-2565 Cultivado en: ABM con SingleQuots
Material y reactivos
100 mm x17 mm Plato Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350
Pipeta serológica de 10 mL	ThermoFisher Scientific	170361
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 15 mL	ThermoFisher Scientific	339650
ABM Medio Basal 500 mL	Lonza	CC-3187	Para astrocitos humanos primarios. ABM+: contiene todos los aditivos de la mezcla de suplementos. ABM-: todos los aditivos excepto rhEGF y FBS
Solución de desprendimiento de células Accutase	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Suplementos y factores de crecimiento	Lonza	CC-4123
Suplemento de B27	Gibco	17504-044	Tanto para GBM + como para - medio
Águila mediana basal	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Placas de 6 pocillos con tratamiento Corning Costar TC	Sigma-Aldrich	CLS3506
Insertos de cultivo celular con membrana de poliéster Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Disolver en 50 mL de BME-1 y filtro estéril antes de añadir al medio
Jamón Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F-12	Gibco	21331-020	Específico para el cultivo de las esferas derivadas del paciente aisladas en nuestro laboratorio; puede variar para otras líneas celulares de glioma
EBM-2 crecimiento Medio SupplementMix	PromoCell	C-39216	EBM+: contiene todos los aditivos de la mezcla de suplementos. EBM-: todos los aditivos excepto VEGF-A y FBS
Medio basal endotelial 2 (EBM-2)	PromoCell	C-22211	EBM+: contiene todos los aditivos de la mezcla de suplementos. EBM-: todos los aditivos excepto VEGF-A y FBS
Suero fetal bovino (FBS), calificado, inactivado por calor, aprobado por la UE Origen de América del Sur	ThermoFisher Scientific	10500056
Sal sódica fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377
Placas de pocillos Greiner CELLSTAR de 96	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Pozos de poliestireno negro de fondo plano (con fondo microtransparente)
Menzel-Gläser 0,9 cm redondo de borosilicato Cubreobjetos	Termo Científico	10313573
Tabletas PBS	Medicago	09-9400-100	Un comprimido por litro de dH2O; a continuación, esterilizar la solución en autoclave
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407
FEAG humano recombinante	Peprotech	GMP100-15	Para GBM+ medio
FGF humano recombinante básico (154 a.a.)	Peprotech	100-18B	Para GBM+ medio