Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Homogeneización
NOTA: Todos los pasos se realizan a 4 °C.
- Añadir 1,5 mL de tricaína (15 mM) a placas de Petri de 90 mm que contengan 50 larvas en 50 mL de medio embrionario E3 tratado con PTU de 200 μM para anestesiarlas terminalmente.
- Aspire 10 larvas anestesiadas de las placas de Petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL.
- Transfiera las larvas anestesiadas de 10 por 10 a una placa de Petri de 55 mm llena de medio embrionario E3 congelado + tricaína.
- Bajo un microscopio estereoscópico, alinee 10 larvas en el centro de la placa de Petri. Luego, transecte las cabezas de las larvas por encima del saco vitelino con microtijeras quirúrgicas (excluya la vejiga natatoria para evitar cabezas flotantes).
- Aspire las cabezas de las placas de Petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL. Espere hasta que todas las cabezas se reúnan dentro de la punta de la pipeta y luego transfiéralas a un homogeneizador de vidrio que contenga 1 mL de Media A helado (transfiera en un volumen mínimo para reducir la dilución de Media A por E3 + Tricaína). Mantenga el homogeneizador de vidrio en hielo. Utilice un homogeneizador por condición experimental.
- Reemplace cada placa de Petri pequeña que contenga E3 + Tricaína helada por una nueva cada 30 minutos para asegurar que la transección se realice en medio E3 + Tricaína frío.
- Reemplace el medio A helado en el homogeneizador de vidrio cuando el color comience a desvanecerse.
NOTA: La dilución de Media A puede alterar el tejido de la cabeza debido a los cambios de temperatura.
- Una vez que se hayan recogido todas las cabezas (600 cabezas/condición), retire el volumen máximo de Media A del homogeneizador de vidrio y reemplácelo con 1 mL de Media A fresco e helado.
- Altera el tejido cerebral con un homogeneizador de vidrio hermético sobre hielo. Realice 40 rondas de trituración y turnos para larvas de 3 a 5 dpf y 50 para larvas de 7 y 8 dpf.
- Añadir 2 mL de Media A a la suspensión celular (1 mL Media A/200 cabezas), lo que diluirá las células y reducirá su aglomeración con mielina para facilitar su separación durante la centrifugación en medio de gradiente de densidad.
- Para eliminar la aglomeración celular, pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm colocado encima de un tubo falcon frío de 50 mL mantenido en hielo. Repita esta operación 3 veces.
- Transfiera 1 mL de suspensión celular a tubos fríos de 1,5 mL y gírelos a 300 g durante 10 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante con una jeringa de 10 ml + aguja de 23 g x 1 ''.
- Vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de medio de gradiente de densidad helado del 22% suavemente superpuesto por 0,5 mL de DPBS helado 1x (no los mezcle, se verá una interfase entre ambas soluciones).
- Tubos de centrifugado a 950 g sin freno y aceleración lenta durante 30 min a 4 °C.
NOTA: Este paso separa la mielina de otras células secuestrándola en la interfase de DPBS 1x y medio con gradiente de densidad del 22%, mientras que las células se pelletizarán en el fondo del tubo. La eliminación de mielina es más eficiente cuando la concentración celular no es demasiado alta.
- Con una jeringa de 10 mL + aguja de 23G x 1'', deseche el máximo de DPBS, medio de gradiente de densidad y mielina atrapados en su interfase.
- Lavar las células con 0,5 mL de Media A + 2% de suero de cabra normal (NGS), luego centrifugar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 °C.
- Deseche el máximo del sobrenadante, luego agrupe todos los gránulos de células de la misma condición experimental juntos en 1 mL de Media A + 2% NGS.
- Si las células de interés expresan una microglía o macrófagos fluorescentes similares a las proteínas de mpeg1:eGFP o neuronas de peces transgénicos NBT:DsRed, pase la suspensión celular a través de una tapa de filtro celular de 35 μm y transfiéralas a tubos fríos de 5 mL FACS en hielo, protegidos de la luz.
NOTA: Alternativamente, se puede realizar la inmunotinción de la microglía.