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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inmunotinción de microglía
NOTA: Todos los pasos se realizan a 4 °C.
- Vuelva a suspender el pellet celular obtenido de células de cultivo cerebral con 0,3 mL de Media A + 2% de suero de cabra normal o NGS. Divídalos en 3 tubos de 1,5 mL: uno para células no teñidas para medir la autofluorescencia de las células de interés, segundo para el anticuerpo secundario (1/200) para medir la unión inespecífica del anticuerpo secundario a la microglía, y tercero como prueba (anticuerpo monoclonal de ratón 4C4 (específico de la microglía) (1/20) + anticuerpo secundario (1/200)).
- Agregue endotoxinas bajas, libres de azidas (LEAF) al 1% a las células (todos los tubos) para bloquear las interacciones CD16/CD32 con el dominio Fc de las inmunoglobulinas. Incubar las células durante 10 minutos con una agitación suave cada 5 minutos.
- Añadir el anticuerpo 4C4 (1/20) a las células (tubo 3) e incubar durante 30 min con agitación suave cada 10 min.
- Centrifugar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 °C y, a continuación, desechar el sobrenadante.
- Lavar una vez con 0,5 mL de Media A + 2% NGS, luego centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender el pellet celular con 0,5 ml de Media A + 2% NGS e incube las células con LEAF al 1% durante 10 min con agitación suave cada 5 min.
- Añadir anticuerpo secundario (1/200) a las células (tubo 2 y 3). Incubar las células durante 30 min con agitación suave cada 10 min y protección ligera.
- Centrifugar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 °C y, a continuación, desechar el sobrenadante.
- Lave dos veces con 0,5 mL de Media A + 2% NGS, luego vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de Media A + 2% NGS.
- Pase la suspensión celular a través de una tapa de filtro de celdas de 35 μm y transfiéralas a tubos fríos de clasificación celular activados por fluorescencia de 5 mL o FACS en hielo, protegidos de la luz.
>2. Clasificación de celdas (FACS)
NOTA: Realice todos los pasos a 4 °C.
- Ordene neuronas, macrófagos/microglía y microglía mediante un FACS.
NOTA: Este paso generalmente lo realiza un miembro del personal de las instalaciones de FACS y los ajustes dependen del tipo de equipo utilizado.
- Agregue DAPI a una concentración de 1 μg/mL en cada tubo FACS para marcar las células muertas.
- Configure FACS y clasifique las neuronas, los macrófagos/microglía o la microglía de todas las células cerebrales. Separe las celdas de los escombros en función de su tamaño y granularidad, luego controle las celdas individuales mediante dispersión directa y dispersión lateral. Excluya las células muertas mediante el etiquetado DAPI de las células vivas. Identifique neuronas, macrófagos/microglía o microglía por su respectiva tinción positiva.
- Recoja las células en tubos de 1,5 mL que contengan 1 mL de Media A helado + 2% de NGS en hielo. Utilice diferentes tubos para cada tipo de célula.
- Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Lavar una vez con 0,5 mL de Media A y luego desechar el máximo de sobrenadante.