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1. Creación de variantes de BRCA1 utilizando herramientas de edición de bases mediadas por CRISPR
>NOTA: Si no se utilizan líneas celulares HAP1-BE3, el ADN plasmídico que codifica BE3 puede ser co-transfectado con el ARNg dirigido a BRCA1. En comparación con la co-transfección de plásmidos BE3 y ARNg, la transfección de plásmido ARNg a células HAP-BE3 induce una edición de bases eficiente de hasta 3 veces en el locus objetivo en nuestras manos.
- Siembre 5 x 105 células HAP1-BE3 (o células HAP1 en el caso de los métodos de co-transfección) por pocillo en placas de 24 pocillos 1 día antes de la transfección. En el momento de la transfección, cultiva las células para alcanzar una densidad adecuada (70%-80% de confluencia).
- Transfecte los ARNg dirigidos a BRCA1 utilizando los reactivos de transfección adquiridos (Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 1 μg de ARNg dirigidos a BRCA1 (con 1 μg de ADN plásmido que codifica BE3 en el caso de los métodos de cotransfección) para inducir la conversión de C:G a T:A en los sitios diana de BRCA1. Incubar las células a 37 °C y subcultivar cada 3-4 días.
- Coseche los gránulos de celda 3, 10 y 24 días después de la transfección para analizar la eficiencia de la edición de la base (las muestras de 3 días después de la transfección se analizan reclasificándolas como muestras del día 0).
- Extraiga el ADN genómico utilizando el kit de purificación de ADN genómico (Tabla de Materiales).
NOTA: Recomendamos optimizar las condiciones de transfección con una relación variable entre el reactivo y el ADN. La condición óptima para la transfección de HAP1 es una proporción de 4:1 de reactivo en el ADN en nuestras manos.