Cromatografía líquida de interacción hidrofílica: una técnica para separar analitos polares hidrófilos utilizando perlas hidrofílicas

Resumen

Fuente: Liu, D., et al. Análisis de N-glicanos de inmunoglobulina G por cromatografía líquida de ultra rendimiento. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el principio de separación de compuestos polares hidrofílicos utilizando cromatografía líquida de interacción hidrofílica. Esta técnica ayuda en la purificación de varios analitos polares, incluidos los N-glicanos.

Protocolo

1. Cromatografía de interacción hidrofílica y análisis de glicanos

1. Acondicionamiento de instrumentos UPLC y preparación de fases móviles
   1. Prepare fases móviles, incluido el disolvente A: 100 mM de formiato de amonio (pH = 4,4), el disolvente B: 100 % acetonitrilo, el disolvente C: 90 % de agua ultrapura (10 % de metanol) y el disolvente D: 50 % de metanol (agua ultrapura).
   2. Abra el software para controlar las fases móviles.
   3. Lave los instrumentos UPLC a un caudal de 0,2 mL/min (50 % de disolvente B y 50 % de disolvente C) durante 30 min, luego a un caudal de 0,2 mL/min (25 % de disolvente A y 75 % de disolvente B) durante 20 min, y luego un caudal de 0,4 mL/min de equilibrado.
2. Disuelva los N-glicanos premarcados con 2-aminobenzamida (2-AB) en 25 μL de una mezcla de acetonitrilo al 100% y agua ultrapura en una proporción de 2:1 (v/v). A continuación, centrifugar a 134 × g durante 5 min (4 °C) y cargar 10 μL de los N-glicanos marcados en los instrumentos UPLC.
3. Separe los N-glicanos marcados a un caudal de 0,4 mL/min con un gradiente lineal de acetonitrilo del 75% al 62% durante 25 min. A continuación, se realizó una prueba analítica mediante una escalera de calibración de dextrano/columna de glicopéptidos en un UPLC a 60 °C (en este caso, las muestras se mantuvieron a 4 °C antes de la inyección).
4. Detecte la fluorescencia de N-glicanos en longitudes de onda de excitación y emisión de 330 nm y 420 nm, respectivamente.
5. Integre los glicanos en función de la posición máxima y el tiempo de retención.
6. Calcule el valor relativo de cada pico de glicano (GP)/todos los picos de glicanos (GP) (porcentaje, %) de la siguiente manera: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-aminobenzamida, 2-AB	Sigma, China
acetonitrilo	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formiato de amonio	Pekín Minruida Tecnología Co., Ltd.
Escalera de calibración de dextrano/columna de glicopéptidos	Watts technology Co., Ltd, China
Potenciar 3.0	Waters technology Co., Ltd, América
Kit de etiquetado GlycoProfile 2-AB	Sigma, China
metanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Medidor de agua pura Milli-Q	Millipore Co., Ltd, América	202-2AB
Pistola de transferencia de líquidos	Smer Fell Ciencia y Tecnología Co., Ltd, China	Ventaja A10
Refrigerador de temperatura ultra baja	Thermo Co., Ltd, América	PB-10
Cromatografía líquida de ultra rendimiento	Watts technology Co., Ltd, China
Bomba de vacío	Watts technology Co., Ltd, China	4672100, 0,5-10 μl y 10-100 μl y 20-200 μl y 1000 μl