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1. Derivatización por fluorescencia de ácidos siálicos
- Prepare 10 mL de solución de OPD, compuesta por 100 mg de o-fenilendiamina y 208 mg de sulfito de hidrógeno de sodio en 10 mL de H₂O destilado.
- Añadir 20 μL de solución de OPD a las muestras de ácido siálico. Agitar vigorosamente durante 30 s e incubar las muestras durante 4 h a 80 °C en la oscuridad (es decir, envolver los microtubos en papel de aluminio).
- Deje que las muestras se enfríen durante 5 minutos, agregue 80 μL de H₂O destilado y centrifugue los tubos a 14,000 x g durante 1 minuto.
- Transfiera 80 μL del sobrenadante a un vial de HPLC de alta recuperación de 300 μL. Las muestras de ácido siálico derivatizado pueden almacenarse a 4-6 °C durante un máximo de una semana.
2. Análisis por HPLC de derivados del ácido siálico
- Analice las muestras utilizando un sistema de HPLC estándar conectado a un detector de fluorescencia en línea.
- Utilice una columna C18 de fase reversa con las dimensiones estándar de 250 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro para el análisis.
- Prepare el disolvente A diluyendo 200 mL de solución madre con 800 mL de agua de grado LCMS (LCMS - cromatografía líquida espectrometría de masas). La solución madre en sí se puede preparar de la siguiente manera:
- Añadir 46 g de ácido fórmico a 800 mL de H₂O de grado LCMS.
- Ajuste el pH a 4,5 añadiendo gota a gota una solución de hidróxido de amonio (puriss. p.a.).
- Transfiera el disolvente a un cilindro de medición y llene hasta 1.000 ml con H₂O de grado LCMS. Esta solución madre puede almacenarse a 4-6 °C durante un máximo de 3 meses.
- Para el disolvente B, utilice acetonitrilo de grado LCMS.
- Separar los derivados del ácido siálico a un caudal de 1 mL/min con la siguiente elución en gradiente:
- Comience añadiendo un 10% de disolvente B mezclado con el disolvente A.
- De 0 min a 15 min, aumente gradualmente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal hasta el 60%.
- De 15 min a 16 min, aumente rápidamente la proporción de solvente B con un gradiente lineal de 60% a 90%. Esto inicia el lavado de la columna de HPLC.
- Para lavar aún más la columna de HPLC, mantenga el nivel de disolvente B al 90 % entre 16 y 18 minutos antes de reducir gradualmente el nivel de disolvente B de nuevo al 10 % entre 18 y 19 minutos.
- Vuelva a equilibrar la columna de HPLC a las condiciones iniciales de 10% B entre 19 y 24 min.
- Inyecte 50 μL de muestra en el sistema de HPLC.
- Monitorice los eluyentes utilizando las longitudes de onda de excitación/emisión del detector de fluorescencia de 373/448 nm, y los ácidos siálicos derivatizados se pueden esperar en los tiempos de retención aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) y 10 min (para Neu5Ac-OPD).
- Calcule la cantidad relativa de Neu5Gc (FNeu5Gc) a partir de las áreas de pico de fluorescencia de Neu5Ac (ANeu5Ac) y Neu5Gc (ANeu5Gc) de la siguiente manera:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). En el caso de las muestras de leche e hígado del ratón Cmah homocigoto knock-out, FNeu5Gc debe ser del 0%, mientras que los valores de FNeu5Gc de ratones heterocigotos y de tipo salvaje pueden variar ampliamente en función de la edad del ratón y del tipo de tejido (entre el 2% y el >90%) con márgenes de error esperados del ±12%.