Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa: un método robusto para la cuantificación de ácidos siálicos marcados y derivatizados con fluorescencia aislados de hígado de ratón

Resumen

Fuente: Cao, C. et al. Determinación de ácidos siálicos en muestras de hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y CMAH.J. Vis. Exp.(2017)

En este video, demostramos la detección de ácidos siálicos, ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico, utilizando cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, después de la derivatización con un reactivo de marcado fluorescente adecuado para ayudar en la detección de fluorescencia.

Protocolo

1. Derivatización por fluorescencia de ácidos siálicos

1. Prepare 10 mL de solución de OPD, compuesta por 100 mg de o-fenilendiamina y 208 mg de sulfito de hidrógeno de sodio en 10 mL de H₂O destilado.
2. Añadir 20 μL de solución de OPD a las muestras de ácido siálico. Agitar vigorosamente durante 30 s e incubar las muestras durante 4 h a 80 °C en la oscuridad (es decir, envolver los microtubos en papel de aluminio).
3. Deje que las muestras se enfríen durante 5 minutos, agregue 80 μL de H₂O destilado y centrifugue los tubos a 14,000 x g durante 1 minuto.
4. Transfiera 80 μL del sobrenadante a un vial de HPLC de alta recuperación de 300 μL. Las muestras de ácido siálico derivatizado pueden almacenarse a 4-6 °C durante un máximo de una semana.

2. Análisis por HPLC de derivados del ácido siálico

1. Analice las muestras utilizando un sistema de HPLC estándar conectado a un detector de fluorescencia en línea.
2. Utilice una columna C18 de fase reversa con las dimensiones estándar de 250 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro para el análisis.
3. Prepare el disolvente A diluyendo 200 mL de solución madre con 800 mL de agua de grado LCMS (LCMS - cromatografía líquida espectrometría de masas). La solución madre en sí se puede preparar de la siguiente manera:
   1. Añadir 46 g de ácido fórmico a 800 mL de H₂O de grado LCMS.
   2. Ajuste el pH a 4,5 añadiendo gota a gota una solución de hidróxido de amonio (puriss. p.a.).
   3. Transfiera el disolvente a un cilindro de medición y llene hasta 1.000 ml con H₂O de grado LCMS. Esta solución madre puede almacenarse a 4-6 °C durante un máximo de 3 meses.
4. Para el disolvente B, utilice acetonitrilo de grado LCMS.
5. Separar los derivados del ácido siálico a un caudal de 1 mL/min con la siguiente elución en gradiente:
   1. Comience añadiendo un 10% de disolvente B mezclado con el disolvente A.
   2. De 0 min a 15 min, aumente gradualmente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal hasta el 60%.
   3. De 15 min a 16 min, aumente rápidamente la proporción de solvente B con un gradiente lineal de 60% a 90%. Esto inicia el lavado de la columna de HPLC.
   4. Para lavar aún más la columna de HPLC, mantenga el nivel de disolvente B al 90 % entre 16 y 18 minutos antes de reducir gradualmente el nivel de disolvente B de nuevo al 10 % entre 18 y 19 minutos.
   5. Vuelva a equilibrar la columna de HPLC a las condiciones iniciales de 10% B entre 19 y 24 min.
6. Inyecte 50 μL de muestra en el sistema de HPLC.
7. Monitorice los eluyentes utilizando las longitudes de onda de excitación/emisión del detector de fluorescencia de 373/448 nm, y los ácidos siálicos derivatizados se pueden esperar en los tiempos de retención aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) y 10 min (para Neu5Ac-OPD).
8. Calcule la cantidad relativa de Neu5Gc (F_Neu5Gc) a partir de las áreas de pico de fluorescencia de Neu5Ac (A_Neu5Ac) y Neu5Gc (A_Neu5Gc) de la siguiente manera:
   F_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc). En el caso de las muestras de leche e hígado del ratón Cmah homocigoto knock-out, F_Neu5Gc debe ser del 0%, mientras que los valores de F_Neu5Gc de ratones heterocigotos y de tipo salvaje pueden variar ampliamente en función de la edad del ratón y del tipo de tejido (entre el 2% y el >90%) con márgenes de error esperados del ±12%.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
productos químicos
Ácido N-acetilneuramínico	sigma	A0812
Ácido N-glicolilneuramínico	sigma	50644	1 mg de alícuota debería ser suficiente
O-fenilendiamina	sigma	694975
Sulfito de hidrógeno de sodio	J&K Scientific Ltd	75234
Análisis de HPLC
Vial de HPLC de alta recuperación	Tecnologías Agilent	#5188-2788
Sistema de HPLC	Shimadzu	Nexera
Detector de fluorescencia para HPLC	Shimadzu	RF-20Ejes
Columna de HPLC	Fenomenex	ODS de hiperclon	250 x 4,6 mm
Grado LCMS H2O	Merck Millipore	#WX00011
Acetonitrilo de grado LCMS	Merck Millipore	#100029	Hipergrado
Solución de hidróxido de amonio	Fluka	#44273	Puriss. p.a.