Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa: un método robusto para la cuantificación de ácidos siálicos marcados y derivatizados con fluorescencia aislados de hígado de ratón

Resumen

Fuente: Cao, C. et al. Determinación de ácidos siálicos en muestras de hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y CMAH.J. Vis. Exp.(2017)

En este video, demostramos la detección de ácidos siálicos, ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico, utilizando cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, después de la derivatización con un reactivo de marcado fluorescente adecuado para ayudar en la detección de fluorescencia.

Protocolo

1. Derivatización por fluorescencia de ácidos siálicos

1. Prepare 10 mL de solución de OPD, compuesta por 100 mg de o-fenilendiamina y 208 mg de sulfito de hidrógeno de sodio en 10 mL de H₂O destilado.
2. Añadir 20 μL de solución de OPD a las muestras de ácido siálico. Agitar vigorosamente durante 30 s e incubar las muestras durante 4 h a 80 °C en la oscuridad (es decir, envolver los microtubos en papel de aluminio).
3. Deje que las muestras se enfríen durante 5 minutos, agregue 80 μL de H₂O destilado y centrifugue los tubos a 14,000 x g durante 1 minuto.
4. Transfiera 80 μL del sobrenadante a un vial de HPLC de alta rec....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
productos químicos
Ácido N-acetilneuramínico	sigma	A0812
Ácido N-glicolilneuramínico	sigma	50644	1 mg de alícuota debería ser suficiente
O-fenilendiamina	sigma	694975
Sulfito de hidrógeno de sodio	J&K Scientific Ltd	75234
Análisis de HPLC
Vial de HPLC de alta recuperación	Tecnologías Agilent	#5188-2788
Sistema de HPLC	Shimadzu	Nexera
Detector de fluorescencia para HPLC	Shimadzu	RF-20Ejes
Columna de HPLC	Fenomenex	ODS de hiperclon	250 x 4,6 mm
Grado LCMS H2O	Merck Millipore	#WX00011
Acetonitrilo de grado LCMS	Merck Millipore	#100029	Hipergrado
Solución de hidróxido de amonio	Fluka	#44273	Puriss. p.a.