Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Medición del volumen embrionario mediante el desplazamiento de agua
NOTA: En este protocolo, se utilizan embriones de 24 h después de la fertilización (hpf) (Figura 1). Los embriones utilizados en las mediciones de volumen no se utilizan en el análisis de etanol.
- Colocar 10 embriones y líquido extraembrionario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado a un volumen de 250 μL (Figura 2A). Agregue agua a la línea de llenado de 250 μL (vea la muestra con agua teñida en la Figura 2B).
- Repita el paso 1.1 para colocar receptáculos para los embriones a los que se les han extraído los coriones.
- Para eliminar el corion, coloque los embriones en sus coriones en una placa de Petri de 100 mm con 2 mg/mL de cóctel de proteasa en medios embrionarios a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Cada pocos minutos, agita suavemente los embriones para romper el corion.
- Una vez que todos los embriones estén libres de su corión, retire los embriones descorionados del cóctel de proteasas/medios embrionarios y colóquelos en una nueva placa de Petri de 100 mm con medios embrionarios frescos para lavar los embriones. Repita este paso de lavado 1 vez más (para un total de 2 lavados). Transfiera los embriones a una placa de Petri fresca de 100 mm.
- Con la punta más pequeña posible y sin dañar los embriones, retire cuidadosamente todo el líquido alrededor de los embriones con una micropipeta p200 (Figura 2C) y pese el agua con una báscula con una precisión de <0,1 mg. Para determinar el volumen de la muestra de 10 embriones, reste el peso/volumen del agua (1 mL de agua = 1 g de agua) extraído de 250 μL. Para determinar el volumen de un solo embrión, divida la diferencia entre 250 μL y el peso del agua extraída por 10,
2. Tratamiento de embriones con etanol
- Recoja los embriones de los tanques de apareamiento y colóquelos en una placa de Petri estándar de 100 mm. No contar más de 100 embriones por placa de Petri e incubar a 28,5 °C.
nota: Si se va a eliminar el corion (paso 1.2), es necesario eliminarlo antes de agregar etanol.
- A 6 hpf, agregue hasta 100 embriones a una nueva placa de Petri estándar de 100 mm, ya sea con medios para embriones o medios para bebés + 1% de etanol (v/v). Cubra, pero NO selle la placa de Petri. Coloque los embriones en una incubadora de baja temperatura a 28,5 °C durante 18 h, o hasta que los embriones alcancen el punto de tiempo de desarrollo de 24 hpf.
3. Preparación del flujo de trabajo antes de procesar los embriones para la cromatografía de gases en el espacio de la cabeza
- Prepare una solución de 5 M de NaCl en agua (se necesitarán 450 μL por tubo de muestra) para desnaturalizar todas las proteínas y prevenir el metabolismo del etanol. Prepare el cóctel de proteasas a una concentración de 2 mg/mL en medios embrionarios.
- Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y un vial de cromatógrafo de gases de 2 mL para cada muestra. Etiquete los viales de cromatógrafo de gases adicionales de 2 mL para los estándares de etanol que se describen a continuación, así como los blancos de cóctel de aire, agua y NaCl/proteasa de 5 M.
- Configure tres micropipetas p200, dos configuradas a 50 μL y la tercera configurada a 200 μL; una micropipeta p1000 configurada a 450 μL y una micropipeta p2 configurada a 2 μL. En el caso de las pipetas de vidrio utilizadas para transferir embriones de las placas de Petri a los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, pase rápidamente la punta de la pipeta a través de una llama para alisar los bordes y no dañar los embriones al introducirlos en la pipeta.
4. Procesamiento de embriones para cromatografía de gases en el espacio de la cabeza
NOTA: Tanto los embriones en sus coriones como los previamente extraídos de sus coriones se tratan de la misma manera para mantener la consistencia en el cálculo de los factores de dilución.
- Con los dos micropipetes p200 ajustados a 50 μL, extraiga 50 μL de la solución de cóctel de proteasa en uno y extraiga 50 μL de agua en el segundo.
- Con la pipeta de vidrio y la micropipeta, coloque rápidamente 10 embriones (a partir del paso 2.2) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cierre el tapón (como se describe en la figura 2A). Repita el procedimiento para todas las muestras que se van a analizar, los controles y los embriones tratados con etanol.
- Con la micropipeta p200 ajustada a 200 μL, abra rápidamente el tapón y elimine todos los medios embrionarios residuales (como se describe en la figura 2C). Coloque rápidamente la pipeta que contiene 50 μL de agua en el tubo y agregue rápida pero suavemente (para no dañar los embriones) y luego retire el agua. Agregue rápidamente 50 μL de la solución de cóctel de proteasa del pipeto en espera y cierre la tapa del tubo (Figura 2D).
nota: Realice este proceso una muestra a la vez.
- Deje reposar la muestra en RT durante 10 minutos para permitir que el cóctel de proteasas degrade el corion. A continuación, añada rápidamente 450 μL de NaCl 5 M y cierre el tapón del tubo (Figura 2E). Agite las muestras durante 10 min. Para acelerar el proceso, configure el mezclador para que vórtice varias muestras al mismo tiempo.
NOTA: Agregue una pequeña cantidad (~ 100 μL) de una mezcla de perlas de sílice (2 tamaños, perla de 0,5 mm y perla de 1 mm) a cualquier tubo con embriones de más de 24 hpf. En los embriones más viejos, la notocorda permanecerá intacta independientemente del tiempo que estén homogeneizados.
- Después de homogeneizar durante 10 minutos, extraiga rápidamente 2 μL de sobrenadante de embrión homogeneizado y añádalo a un vial de cromatógrafo de gases. Selle rápidamente el vial con el tapón de politetrafluoroetileno.
5. Preparación de medios y estándares de etanol
- Para preparar los patrones de medios, diluya los medios en un factor de 10 con una solución de cóctel de NaCl/proteasa de 5 M. Añada 2 μL de cada muestra a un vial de cromatógrafo de gases y selle con un tapón de politetrafluoroetileno.
- Para preparar los patrones de etanol, cree una dilución en serie de etanol al 100% en una solución de cóctel de NaCl/proteasa 5 M a las siguientes concentraciones: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 mM. Añada 2 μL de cada patrón a un vial de cromatógrafo de gases y selle con un tapón de politetrafluoroetileno.
6. Preparación de la cromatografía de gases en el espacio de cabeza
NOTA: La cromatografía de gases en el espacio de cabeza se utiliza para cuantificar los niveles de etanol, no para la separación.
- Ajuste el calentador del muestreador automático a 58 °C y enciéndalo. Deje que el calentador alcance los 58 °C y encienda las líneas de aire y gas hidrógeno que alimentan el cromatógrafo de gases (para la ionización de llama utilizada para cuantificar el etanol).
NOTA: El psi debe configurarse para que el cromatógrafo funcione correctamente de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Asegúrese de que la línea de helio esté encendida y ajustada a la psi adecuada.
- Para el tabique, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no sea >100. Para la fibra de inyección, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no sea >500.
NOTA: Si alguno de ellos supera la cantidad de inyecciones, será necesario cambiarlas antes de ejecutar las muestras de prueba.
- Encienda el software de análisis y asegúrese de que la estación de trabajo esté configurada correctamente. Almacene todos los datos de acuerdo con los estándares del laboratorio/departamento. Cree una nueva lista de ejemplos para los ejemplos que se van a ejecutar.
- Inicie el método de inicio y espere a que el detector de ionización de llama se estabilice antes de ejecutar las muestras. Una vez estable, ejecute el método de inicio del software para limpiar la fibra.
7. Mediciones de muestras mediante cromatografía de gases en el espacio de cabeza
- Una vez completado el método de inicio, cree 1 nueva línea por muestra en la lista de muestras. Desde el menú de métodos en el software de análisis, cargue 436 Current spme etanol 2013 3min absorbe 2_5min rg ejecución. METH para cada muestra de la lista de muestras.
- Rellene la lista de muestras, empezando por los blancos de cóctel de aire, agua, 5 M de NaCl/proteasa. A continuación, introduzca los estándares en orden, de 0,3125 a 40 mM. Siga los estándares con una segunda ronda de blancos, aire, agua y cóctel de 5 M de NaCl/proteasa.
- Introduzca todas las muestras de sobrenadante de embriones homogeneizados que se van a analizar, desde la concentración de etanol prevista más baja hasta la más alta. Termine ingresando a una tercera y última ronda de los blancos de cóctel de aire, agua y 5 M de NaCl / proteasa.
- Añada los viales de cromatógrafo de gases al muestreador automático en el orden en que se introdujeron las muestras. Deje que las muestras se calienten durante 10 a 15 minutos. Inicie las ejecuciones de muestra en el software.
- Una vez que se hayan ejecutado todas las muestras y los blancos finales, active el método de apagado en el software agregando una muestra final en la lista de muestras y ejecutando el modo de espera. METANFETAMINA. Realice una copia de seguridad de todos los datos adquiridos durante las ejecuciones de muestra. Apague el equipo en el siguiente orden: calentador automático, tanque de hidrógeno y, solo después de que la temperatura del cromatógrafo alcance los 30 °C, el tanque de aire. Deje el tanque de helio encendido para preservar la columna de cera.
8. Integración del pico de etanol de la muestra y análisis de la concentración de la muestra
NOTA: Todos los valores desde 8.3 en adelante se calcularon en un archivo de Excel que todas las ecuaciones precompletaron.
- Una vez completado el método de apagado, haga clic en Abrir cromatograma. Abra la carpeta que contiene los resultados. Las muestras se integran automáticamente en este programa.
- En los resultados, asegúrese de que se han integrado los picos correctos (picos de etanol entre 2 y 2,5). Una vez que se hayan confirmado todas las muestras, imprima o exporte los resultados.
- Traza la altura máxima de los estándares de etanol en un gráfico. Calcule la pendiente, la intersección Y y los valores de R2 para los estándares de etanol (R2 debe ser >0,99).
nota: Estos valores se utilizarán para determinar la concentración de etanol a partir de la altura del pico de la muestra.
- Para cada muestra, reste la altura máxima de la muestra de la intersección Y de los patrones de etanol. Divida este valor por la pendiente de los patrones de etanol para obtener el valor de etanol para cada muestra en los viales de GC.
- Para calcular la concentración de etanol en los embriones, primero se debe calcular el factor de dilución para cada muestra. Tome la medida de volumen calculada en el paso 1.3 de este protocolo y divídala por la medida de volumen más 500 μL. Esto representa la solución de cóctel de NaCl/proteasa de 5 M añadida a cada muestra durante el procesamiento del embrión (pasos 4.3 y 4.4).
- Usando este factor de dilución de muestra, multiplique por el valor de etanol de la muestra para cada muestra. Los resultados estarán en concentración de mM. Calcule las muestras de referencia de medios multiplicando el valor de etanol de medios por el factor de dilución de 10,
