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1. Funcionalización del array con el anticuerpo biotinilado
- Prepare las siguientes soluciones.
- Tampón T50, una solución de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y 50 mM de NaCl. La solución es estable durante 1 mes en RT.
- T50-BSA complementando el tampón T50 con 0,1 mg/mL de BSA. Mantenga la solución preparada en hielo.
- 10 mg/mL de borohidruro de sodio (NaBH4) en 1x PBS. Prepare esto inmediatamente antes de usar.
- 0,2 mg/mL de NeutrAvidin (ver Tabla de Materiales) en tampón T50.
cautela: NaBH4 es un agente reductor y es inflamable. Siempre purgue el recipiente con gas nitrógeno después de usarlo y guárdelo en un desecador.
- Funcionalizar la matriz con el anticuerpo biotinilado.
- Retire las matrices funcionalizadas de PEG-biotina del congelador y equilibre el tubo cónico a RT antes de abrirlo. Coloque el cubreobjetos con la matriz orientada hacia arriba sobre una placa de cultivo de tejidos de 100 mm (TC100) revestida con película de sellado.
nota: Minimice la iluminación del techo. Todas las soluciones deben "formarse un cordón" en los cuadrados definidos por la matriz hidrofóbica. Agregue un volumen adecuado de solución para cubrir completamente cada cuadrado (generalmente 10-15 μL) y no permita que el líquido se desborde del espacio definido. Para eliminar líquidos rápidamente, utilice una línea de vacío interna conectada a un matraz de vacío para capturar los desechos. Deje que NaBH4 se desgasifique durante 1 h antes de desecharlo dejando el tubo abierto en la campana de gases químicos. El tratamiento con NaBH4 es necesario para reducir la autofluorescencia de fondo, reduciendo así las detecciones de falsos positivos de una sola molécula.
- Trate cada cuadrado de la matriz con 10 mg/mL de NaBH4 en 1x PBS durante 4 min en RT. Lavar tres veces con PBS.
- Incubar cada cuadrado durante 5 min con 0,2 mg/mL de NeutrAvidin en T50. Lavar tres veces con T50-BSA.
nota: NeutrAvidin se une a la biotina PEG y proporciona un sitio de unión para los anticuerpos biotinilados.
- Incubar cada cuadrado durante 10 min con 2 μg/mL de anticuerpo biotinilado específico de POI en T50-BSA; lavar tres veces con T50-BSA.
nota: El presente protocolo utiliza IgG anti-EGFR biotinilada (ver Tabla de Materiales) para capturar EGFR-GFP.
2. SiMPull de POI de lisados de células enteras
NOTA: Coloque la antena TC100 de matrices de SiMPull funcionalizadas en hielo para el resto de la preparación de SiMPull. Este paso es la extracción de un POI del lisado total de proteínas. El lisado no debe reutilizarse después de la descongelación.
- Prepare las siguientes soluciones.
- Prepare 4% de paraformaldehído (PFA)/0.1% de glutaraldehído (GA) en 1x PBS.
cautela: El PFA y el GA son fijadores químicos tóxicos y potencialmente cancerígenos. Use EPP. Deseche los productos químicos como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
- Prepare 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4.
- Descongele y mezcle el lisado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Mantener en hielo.
- Diluir 1 μL del lisado en 100 μL de T50-BSA/PPI.
nota: Si es necesario, determine el factor de dilución apropiado del lisado de proteína total aplicando un rango de diluciones a la matriz. La densidad óptima de receptores SiMPull por área de matriz es de 0,04-0,08/μm2.
- Incubar el lisado en la matriz durante 10 min; luego lavar cuatro veces con T50-BSA/PPI helado.
- Diluir el anticuerpo antifosfotirosina conjugado AF647 (ver Tabla de Materiales) en T50-BSA/PPI helado e incubar en la matriz durante 1 h.
nota: En el presente protocolo, se utiliza una IgG anti-pTyr (PY99)-AF647 para identificar la población fosforilada de EGFR-GFP. El uso de anticuerpos marcados directamente elimina la necesidad de anticuerpos secundarios, lo que aumenta las opciones de etiquetado y mejora la consistencia de los resultados. Los anticuerpos marcados con fluorescencia se pueden obtener de fuentes comerciales. Si no están disponibles comercialmente, los anticuerpos se pueden etiquetar de forma personalizada utilizando técnicas de bioconjugación estándar, y hay kits de bioconjugación comerciales disponibles. Cada lote de anticuerpos marcados con fluorescencia debe analizarse para determinar las condiciones óptimas de etiquetado mediante la realización de SiMPull para medir una curva de dosis y encontrar el punto de saturación.
- Lavar seis veces con T50-BSA helado durante un total de 6-8 min.
- Lavar dos veces con 1x PBS helado.
- Incubar la matriz con una solución de PFA al 4 % y GA al 0,1 % durante 10 minutos para evitar la disociación de anticuerpos.
- Lavar dos veces durante 5 min cada una con 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4/PBS para inactivar los fijadores.
nota: Para experimentos con más de un anticuerpo (por ejemplo, para detectar múltiples sitios de fosfotirosina), repita los pasos 2.5-2.9.
3. Adquisición de imágenes
NOTA: La adquisición de imágenes de una sola molécula se realiza utilizando un objetivo TIRF de 150x y un divisor de imágenes que captura cada canal espectral en un cuadrante específico de la cámara emCCD (ver Tabla de Materiales). Las imágenes de calibración se adquieren primero para permitir el registro de canales y la calibración de la ganancia de la cámara con una rejilla de alineación de canales con nanopatrones (nanogrid) que contiene 20 matrices de 200 x 20 de orificios de 200 ± 50 nm a una distancia intraorificio de 3 ± 1 μm (tamaño total ~ 60 μm × 60 μm).
- Realice el registro del canal siguiendo los pasos que se indican a continuación.
nota: Es necesario un registro de canal preciso para calcular correctamente la colocalización de los emisores. Este paso es fundamental.
- Limpie el objetivo de aceite y deposite una gota de aceite en el objetivo. Coloque la nanorrejilla en el escenario para obtener imágenes. Usando luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula.
nota: Las imágenes con la nanorred se adquieren utilizando luz transmitida, que pasa a través de la nanorred y se detecta en todos los canales espectrales. Alternativamente, se pueden utilizar perlas multifluorescentes que emiten fluorescencia detectada en cada canal. La adquisición de imágenes deberá optimizarse de acuerdo con la configuración de cada microscopio.
- Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula. Asegúrese de que los píxeles no estén saturados. Guarde la serie de imágenes como "Fiducial".
- Desenfoca la nanorred para crear un patrón de Airy. Adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia. Guarde la imagen como "Ganancia".
- Adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz que vaya a la cámara. Guarde la imagen como "Fondo".
- Adquirir imágenes de SiMPull.
nota: Antes de crear imágenes de la matriz de cubreobjetos, cambie la solución Tris por T50-BSA y equilibre la matriz a RT.
- Limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure el conjunto de cubreobjetos en la platina del microscopio.
- Optimice la potencia de excitación, el ángulo TIRF y el tiempo de integración de la cámara de cada fluoróforo. El objetivo es lograr la mayor relación señal-ruido al tiempo que se minimiza el fotoblanqueo de la muestra. Registre la potencia del láser para mantener la consistencia en mediciones futuras.
nota: En el presente estudio se utilizó un tiempo de exposición de 300 ms para el canal rojo lejano y de 1 s para el canal verde. El láser de 642 nm se utilizó a una potencia láser de aproximadamente 500 μW, mientras que el láser de 488 nm se utilizó a 860 μW, medido antes de la lente del tubo.
- Adquiera imágenes para cada muestra. Primero tome imágenes del canal rojo lejano, seguido de cada fluoróforo de longitud de onda más baja para reducir el fotoblanqueo. Debido al bajo volumen utilizado para cada muestra, verifique el nivel de tampón cada 30-45 minutos y reponga según sea necesario.