Ensayo de bicapa lipídica soportada plana: una técnica in vitro basada en microscopía para investigar el ensamblaje de septinas en imitaciones de membranas biológicas

Resumen

Fuente: Curtis, B. N. et al. Reconstitución del ensamblaje de septinas en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, demostramos un procedimiento para investigar la organización de la septina en una bicapa lipídica soportada por vidrio in vitro utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Protocolo

1. Bicapas lipídicas planas

1. Limpieza con plasma de los portaobjetos
   nota: La limpieza con plasma elimina los contaminantes orgánicos y aumenta la hidrofilicidad del vidrio, lo que garantiza una adsorción eficiente de lípidos. Los siguientes pasos pueden cambiar o ser necesario optimizarlos según el limpiador de plasma y los cubreobjetos de vidrio utilizados.
   1. Purgue el limpiador de plasma durante 5 minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Esto es para garantizar que, cuando se ejecuta el limpiador de plasma, haya principalmente oxígeno en las líneas y la cámara, lo que proporciona preparaciones bicapa más consistentes.
   2. Durante la purga, haga fluir un gas inerte, como N₂ o Ar, sobre los portaobjetos de micro cubreobjetos para eliminar el polvo y las partículas><. opcional: Los portaobjetos de cubreobjetos se pueden lavar rociando cada lado con isopropanol al 100% seguido de agua. Repita el lavado con agua y isopropanol 3 veces y luego seque con un chorro de N₂.
   3. Coloque los portaobjetos de vidrio seco en una cuna de cerámica. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que los cubreobjetos queden paralelos al borde largo de la cámara (esto los mantiene en su lugar durante la limpieza con plasma). Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.
2. Preparación de la Cámara
   nota: El método descrito aquí utiliza cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pocillos de silicona, también pueden ser adecuados.
   1. Con una cuchilla de afeitar o unas tijeras, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 ml (Figura 1).
   2. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado por UV, evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el tubo de PCR pegado en el centro de un cubreobjetos limpiado con plasma.
      nota: Para evitar el pegamento dentro de la cámara, use la cantidad mínima de pegamento para obtener un sello y trátelo rápidamente con UV sin golpear ni perturbar la cámara.
   3. Coloque la cámara bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga durante 5-7 minutos para curar el adhesivo.
3. Formación bicapa
   nota: Los SUV monodispersos deben usarse en este paso para una formación eficiente de bicapas. La Tabla 1 proporciona recetas para todos los tampones utilizados en la formación de bicapas, incluidas las concentraciones de existencias y tampones finales.
   1. Añadir 40 μL de tampón bicapa lipídico soportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl₂; Tabla 1), 10 μL de SUV de 5 mM y 1 μL de 100 mM de CaCl₂ al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y, a continuación, incube a 37 °C durante 20 min.
      nota: Para limitar la evaporación, incube en una placa de Petri cubierta con una toallita húmeda.
4. Lavado del exceso de lípidos
   nota: Este paso elimina el exceso de SUV y actúa como un paso de intercambio de búfer. Es muy importante no raspar la bicapa con la punta de la pipeta durante el lavado; Si el vidrio está expuesto, las septinas y muchas otras proteínas se unirán irreversiblemente, reduciendo la concentración efectiva de proteínas.
   1. Después de la incubación, enjuague la bicapa 6 veces con 150 μL de SLBB, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar cada vez evitando burbujas><. NOTA: Agregue 150 μL directamente a los 50 μL de tampón y SUV ya presentes para un total de 200 μL en el pozo de reacción.
   2. Cuando esté listo para comenzar a incubar con las septinas o con una proteína diferente de su elección, lave la bicapa 6x con 150 μL de tampón de reacción (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14% metilcelulosa, 1 mM BME).
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, haga el tampón de reacción fresco y tenga mucho cuidado al mezclar bien la reacción para evitar burbujas.
   3. En el último paso de lavado, retire 125 μL de tampón de reacción, dejando 75 μL en el pocillo. Añadir 25 μL de septinas diluidas en tampón de almacenamiento de septinas (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) a la concentración deseada e imagen por microscopía TIRF.
      nota: Al configurar este ensayo por primera vez o incorporar una nueva composición de lípidos, es una buena práctica asegurarse de que los lípidos se difundan libremente en la superficie mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Si bien la tasa de recuperación será diferente para las diferentes composiciones de lípidos e inherentemente más baja que para los sistemas independientes, los lípidos no deben estar inmóviles.

Tabla 1: Componentes tampón para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y reacciones. Se muestran los volúmenes de soluciones madre que se incorporan a los tampones y las concentraciones finales de cada componente. El SLB y el PRB pueden almacenarse a temperatura ambiente y reutilizarse entre experimentos. El tampón de reacción y el SSB se hacen nuevos para cada experimento.

Tampón bicapa lipídico soportado (SLBB)
acción	volumen	Concentración final
2 M KCl	1,5 ml	300 mM
1 M HEPES	200 μL	20 mM
500 mM MgCl2	20 μL	1 mM
Agua	8 mL
Tampón de pre-reacción (PRB)
acción	volumen	Concentración final
2 M KCl	166 μL	33,3 mM
1 M HEPES	500 μL	50 mM
Agua	9.33 mL
Tampón de reacción
acción	volumen	Concentración final
2 M KCl	166 μL	33,3 mM
1 M HEPES	300 μL	50 mM
10 mg/mL BSA	1.39 mL	1,39 mg/mL
1% Metilcelulosa	1.39 mL	0.0014
Agua	Hasta 10 mL
Bme	0,7 μL	1 mM
Búfer de almacenamiento Septin (SSB)
acción	volumen	Concentración final
2 M KCl	1,5 ml	300 mM
1 M HEPES	500 μL	50 mM
Agua	Hasta 10 mL
Bme	0,7 μL	1 mM

Resultados

Figura 1: Esquema de la configuración de la cámara de reacción. Para preparar cámaras personalizadas, se corta un tubo de PCR de 0,2 mL donde el tubo comienza a estrecharse y en la tapa (líneas discontinuas rojas). A continuación, el borde sin cortar del tubo cortado se recubre con una fina capa de pegamento activado por UV (azul) y se coloca pegamento sobre un cubreobjetos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de PCR de 0,2 mL con tapa plana, natural	Watson	137-211C(EX)
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Cloruro de magnesio	VWR	7791-18-6
Metilcelulosa 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Cubreobjetos de microvidrio para bicapas planas	Matsunami	terminado	22x22
Adhesivo óptico	Norland Thorlabs	NOA 68	Adhesivo flexible para vidrio o plástico
Limpiador de plasma	Grabado con plasma	PE-25	Voltaje: 120V, 60Hz. Corriente: 15 AMPERIOS
Cloruro de potasio	VWR	0395-1kg
Lámpara UV	Espectrolina	ENF-260C	115 voltios, 60 Hz, 0,20 AMPERIOS
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Beta mercaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
DOPC	Lípidos polares de Avanti	850375
Huevo Liss Rodamina PE	Lípidos polares de Avanti	810146