Ensayo de bicapa lipídica soportada esférica: una técnica para observar el ensamblaje de septinas en microesferas

Resumen

Fuente: Curtis, B. N. et al., Reconstitución del ensamblaje de septinas en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas. J. Vis. Exp. (2022).

Este video describe la técnica de estudio del ensamblaje de la proteína septina en microesferas recubiertas con bicapas lipídicas. Esta técnica ayuda a comprender los ensamblajes dependientes de la curvatura de las proteínas en superficies curvas.

Protocolo

1. Bicapas lipídicas esféricas soportadas

NOTA: Este protocolo utiliza microesferas de sílice suspendidas en agua ultrapura con una densidad del 10%. Para cualquier trabajo sobre los parámetros cinéticos del ensamblaje de proteínas, es importante controlar estrictamente el área total de la superficie de la membrana entre los experimentos y las curvaturas. La Tabla 1 muestra los volúmenes corregidos de perlas y tampón para mantener 5^mm2 de área de superficie total de la membrana.

1. Formación bicapa
   nota: En cuanto a las bicapas planas, es importante contar con SUV de alta calidad para una formación robusta de bicapas. La Tabla 1 enumera el volumen de perlas de una solución de densidad del 10% y sus respectivos volúmenes de SLBB que se utilizan para obtener un área de superficie final de 5^mm2 para un rango de diámetros de cordón.
   1. Las microesferas de sílice (también conocidas como perlas) tienden a asentarse y agruparse; para mezclar las perlas y romper los racimos, haga un vórtice en la botella durante 15 s, luego haga un baño sonicalizado durante 1 minuto y vuelva a hacer un vórtice durante 15 s.
   2. Mezcle el volumen adecuado de perlas (Tabla 1) con el volumen correspondiente de SLBB y 10 μL de SUV de 5 mM en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia de 0,5 mL.
   3. Agite la mezcla de perlas y lípidos de extremo a extremo durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que esta incubación se realice en un rotador para evitar la sedimentación.
2. Preparar cámaras en cubreobjetos pegilados
   nota: En cuanto a las bicapas planas, se utilizan cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pocillos de silicona, pueden funcionar igual de bien.
   1. Mientras las cuentas se balancean, descongele un cubreobjetos pegilado a temperatura ambiente. Corta un tubo de PCR de 0,2 ml y pégalo al cubreobjetos como se describe. Para portaobjetos de 24 mm x 50 mm, pueden caber hasta 10 cámaras en un portaobjetos.
      nota: Este protocolo utiliza cubreobjetos de vidrio pegilado de 24 mm x 50 mm que se preparan con anticipación. En resumen, los cubreobjetos de vidrio se limpian a fondo mediante sonicación en acetona, metanol y 3 M KOH. A continuación, los cubreobjetos se funcionalizan con n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoxisilano y se unen covalentemente al valerato de succinimidilo mPEG. Los cubreobjetos PEGilados acabados se almacenan sellados al vacío a -80 °C. Si bien aquí se sugieren cubreobjetos de vidrio pegilado, otros medios de pasivación, como los métodos BSA o poli-L-lisina, pueden ser efectivos.
3. Lavado del exceso de lípidos
   nota: Este paso funciona para eliminar el exceso de SUV y realizar un intercambio de búfer. Las perlas se lavan 4 veces en total con tampón de prerreacción (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). La Tabla 2 enumera las velocidades de centrifugado en RCF para un rango de diámetros de cordón.
   1. Gire las cuentas en el RCF designado durante 30 s (Tabla 2). Si usa varios tamaños de cuentas, mantenga las cuentas meciéndose hasta que sea el momento de lavarlas.
      nota: No vale la pena sedimentar cuentas más grandes en el mismo giro que las cuentas más pequeñas con la menor velocidad de sedimentación de las cuentas para ahorrar tiempo. Esto puede hacer que las cuentas se peguen entre sí y comprometan la integridad de la bicapa.
   2. Después del primer centrifugado, retire 50 μL de sobrenadante y agregue 200 μL de PRB. Después de la segunda y tercera vueltas, retire 200 μL y agregue 200 μL de PRB. Después del cuarto centrifugado, retire 200 μL y agregue 220 μL de PRB. Pipetear vigorosamente para cada lavado.
      nota: El volumen final de resuspensión es diferente al de los lavados. No haga vórtice las perlas después de la incubación con los lípidos, ya que esto puede dejar espacios en las bicapas. Para evitar la sedimentación mientras se trabaja con los otros tamaños de cordones o se configuran otras partes del ensayo, vuelva a colocar las mezclas de perlas en el rotador de extremo a extremo.
4. Preparación de la reacción
   1. Si va a realizar un ensayo de competición con varios tamaños de cuentas, haga una mezcla 1:1 mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de cuentas. A continuación, mezcle 29 μL de la mezcla de perlas deseada (o de una sola perla) con 721 μL de tampón RXN.
      nota: Es importante mezclar bien las cuentas en cada paso con una pipeta para evitar grupos densos de cuentas; Esto dará como resultado una distribución más uniforme del cordón y un área de superficie total precisa.
   2. Mezcle 75 μL de perlas diluidas y 25 μL de proteína diluida en SSB a los pocillos.
      nota: Por lo general, los autores obtienen imágenes de complejos de septinas de levadura a 1-50 nM.
   3. Si mide septinas en un estado estacionario, incube a temperatura ambiente durante 1 h y luego obtenga imágenes mediante microscopía confocal o near-TIRF><. nota: Esta reacción está diseñada para preservar la superficie total de la membrana de la reacción a 5^mm2 y producir una condición de reacción final de 100 mM de KCl, 50 mM de HEPES, 1 mg/mL de BSA, 0,1% de metilcelulosa y 1 mM de BME.

Tabla 1: Volúmenes normalizados de microesferas. Con el fin de mantener un área de superficie igual de cada tamaño de perla y mantener el área de superficie total de la membrana consistente entre los experimentos, se calcularon los volúmenes para cada tamaño de perla y el amortiguador que normalizaba el área de superficie total.

Diámetro del cordón (μm)	Volumen de perlas bien mezcladas (μL)	Volumen del tampón SLB (μL)	Volumen de SUV (μL)
6.46	8.94	Artículo 61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	Artículo 65.6	10
0.96	1.33	Artículo 68.7	10
0.54	0.75	Artículo 69.3	10
0.31	0.43	Artículo 69.6	10

Tabla 2: Velocidades de sedimentación para microesferas de diferentes diámetros. Para cada diámetro de perla, se utilizaron las velocidades de sedimentación mínimas mostradas para granular las perlas para lavar los liposomas no unidos

Diámetro del cordón (μm)	Velocidad de sedimentación (RCF)
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5.06	0.3

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de PCR de 0,2 mL con tapa plana, natural	Watson	137-211C(EX)
Tubos de baja adherencia de 0,5 mL	Científico de EE. UU	1405-2600
Beta mercaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Cubreobjetos para la confección de cubreobjetos pegilados	Termo Científico	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cubierta de Vidrio 24x50 #1.5
DOPC	Lípidos polares de Avanti	850375
Huevo Liss Rodamina PE	Lípidos polares de Avanti	810146
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Metilcelulosa 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Mini centrífuga
Microesferas de sílice no funcionalizadas	Laboratorios Bangs, Inc.	Depende del tamaño: SS0200*-SS0500*	Sílice en suspensión acuosa
Adhesivo óptico	Norland Thorlabs	NOA 68	Adhesivo flexible para vidrio o plástico
Cloruro de potasio	VWR	0395-1kg
Baño de sonicador	Branson	1510R-MT	Bransonic Limpiador ultrasónico. 50-60 Hz. Potencia: 70W
PI de soja	Lípidos polares de Avanti	840044
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	22331
Lámpara UV	Espectrolina	ENF-260C	115 voltios, 60 Hz, 0,20 AMPERIOS

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