Ensayo alamarBlue: Un método fluorométrico sensible para evaluar los efectos citotóxicos de las formulaciones de lágrimas artificiales sobre la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea humana

Resumen

Fuente: Rangarajan, R. et al. Efecto de las formulaciones de lágrimas artificiales sobre la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea humana después de la exposición a la desecación. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un ensayo fluorométrico in vitro para evaluar los efectos de las formulaciones de lágrimas artificiales en la actividad metabólica celular de las células epiteliales de la córnea utilizando una solución de azul de Alamar a base de resazurina. Una formulación no tóxica mantiene las células en un estado saludable y metabólicamente activo, lo que facilita la reducción de la resazurina en una resorufina altamente fluorescente.

Protocolo

1. Cultivo de células epiteliales corneales humanas

1. Cultive HCEC inmortalizado en frascos de 75 cm² recubiertos de colágeno con 20 mL de la mezcla de medio/nutriente Eagle modificada F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C con 5% de CO₂,
   NOTA: No es necesario agitar.
2. Cambie el medio cada 2 o 3 días.

2. Preparación de las células para la prueba

1. Después de que las células estén casi confluentes, retire el medio de cultivo.
2. Añadir 4-6 mL de solución de disociación celular a cada matraz de 75 cm². Incubar las células a 37 °C hasta que se desprendan (aproximadamente 20-30 min), comprobando periódicamente bajo el microscopio.
3. Añadir 2-6 mL de DMEM/F12 que contenga un 10% de FBS a cada matraz de 75 cm².
4. Transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 50 ml.
5. Centrifugar las células a 450−500 x g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante y resuspender las células en medios precalentados.
6. Cuente las células con un hemocitómetro. Calcule el volumen de medios que contiene un total de 1 x 10⁵ celdas.
7. Agregue 1 x 10⁵ células a cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 48 pocillos. Agregue suficiente medio al pocillo para que el volumen final de medio en el pocillo sea de 0,5 mL de cultivo DMEM/F12 con 10% FBS.
   NOTA: Una formulación de lágrimas artificiales puede causar citotoxicidad que puede medirse mediante una disminución en la actividad metabólica del HCEC. La consistencia de los datos depende de la adición del mismo número de HCEC a cada pozo durante la siembra. La concentración de cultivo recomendada para placas de 48 pocillos es 1 x 10⁵. Debido a que las células de mamíferos pueden asentarse en el tubo de centrífuga después de la resuspensión, se recomienda resuspender las células mediante agitación frecuente mientras se siembran las placas con células para que la suspensión celular tenga el HCEC distribuido equitativamente.
8. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.

3. Sin protocolo de desecación

1. Procedimiento de control
   1. Después de las 24 h de incubación, retire los medios de cultivo de la placa.
   2. Tratar inmediatamente con 150 μL de una formulación de prueba y solución de control de medios.
   3. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 min.
   4. Retire las soluciones de prueba de las celdas.
   5. Agregue 0,5 ml de solución de colorante metabólico al 10% para probar la actividad metabólica. Incubar las células durante otras 4 h a 37 °C y 5% de CO₂.
   6. Después del período de incubación de 4 horas, retire 100 μL de solución de colorante metabólico de cada pocillo y coloque cada 100 μL en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
   7. Mida la fluorescencia de cada pocillo utilizando un lector de placas fluorescentes (Tabla de Materiales). Establezca la longitud de onda de excitación en 540 nm y la longitud de onda de emisión en 590 nm.
2. Sin protocolo de desecación (procedimiento de recuperación)
   1. Repita los pasos 3.1.1 a 3.1.4.
   2. Agregue 0.5 mL de medio DMEM/F12 a cada pocillo.
   3. Incubar un conjunto de cultivos durante 18 h a 37 °C y 5% de CO₂.
   4. Retire el medio y agregue 0,5 ml de solución de colorante metabólico al 10%. Repita los pasos 3.1.6 y 3.1.7.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 96 pocillos	coprotagonista	3370
alamarBlue	Fisher Científico	DAL 1025
Placas de 48 pocillos de Corning	Corning	354505	Se trata de la marca BioCoat recubierta de colágeno
DMEM/F12 con L-glutamina y 15 mM HEPES	Gibco	11039-021	No hay rojo fenol en este medio
Suero Fetal Bovino	Hycone	SH30396.03
Células epiteliales corneales humanas	Universidad de Ottawa	N/A	SV40 inmortalizaron células epiteliales de la córnea humana del Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canadá) y han sido caracterizadas Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalentes funcionales de la córnea humana construidos a partir de líneas celulares. Ciencia. 1999; 286:2169-72.
TrypLE Express (solución de disociación celular)	Fisher Científico	12605036
Citación 5	BioTek	CYT5MPV	Puede leer fluorescencia de 280 a 700 nm (para el ensayo 540/590)