Ensayo alamarBlue: Un método fluorométrico sensible para evaluar los efectos citotóxicos de las formulaciones de lágrimas artificiales sobre la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea humana

Resumen

Fuente: Rangarajan, R. et al. Efecto de las formulaciones de lágrimas artificiales sobre la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea humana después de la exposición a la desecación. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un ensayo fluorométrico in vitro para evaluar los efectos de las formulaciones de lágrimas artificiales en la actividad metabólica celular de las células epiteliales de la córnea utilizando una solución de azul de Alamar a base de resazurina. Una formulación no tóxica mantiene las células en un estado saludable y metabólicamente activo, lo que facilita la reducción de la resazurina en una resorufina altamente fluorescente.

Protocolo

1. Cultivo de células epiteliales corneales humanas

1. Cultive HCEC inmortalizado en frascos de 75 cm² recubiertos de colágeno con 20 mL de la mezcla de medio/nutriente Eagle modificada F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C con 5% de CO₂,
   NOTA: No es necesario agitar.
2. Cambie el medio cada 2 o 3 días.

2. Preparación de las células para la prueba

1. Después de que las células estén casi confluentes, retire el medio de cultivo.
2. Añadir 4-6 mL de solución de disociación celular a cada ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 96 pocillos	coprotagonista	3370
alamarBlue	Fisher Científico	DAL 1025
Placas de 48 pocillos de Corning	Corning	354505	Se trata de la marca BioCoat recubierta de colágeno
DMEM/F12 con L-glutamina y 15 mM HEPES	Gibco	11039-021	No hay rojo fenol en este medio
Suero Fetal Bovino	Hycone	SH30396.03
Células epiteliales corneales humanas	Universidad de Ottawa	N/A	SV40 inmortalizaron células epiteliales de la córnea humana del Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canadá) y han sido caracterizadas Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalentes funcionales de la córnea humana construidos a partir de líneas celulares. Ciencia. 1999; 286:2169-72.
TrypLE Express (solución de disociación celular)	Fisher Científico	12605036
Citación 5	BioTek	CYT5MPV	Puede leer fluorescencia de 280 a 700 nm (para el ensayo 540/590)