Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de monocitos humanos primarios por selección inmunomagnética negativa
- Recoja 40 mL de sangre entera humana fresca (ya sea de un paciente VIH+ o de un control sano) en cuatro tubos de vacío de 10 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (10 mL de sangre por tubo). Utilizando técnicas estériles bajo una cabina de bioseguridad, transfiera los 40 mL de sangre a un tubo cónico de propileno de 50 mL.
- Siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de aislamiento de monocitos humanos seleccionado (Tabla de materiales), agregue 2 mL de cóctel de aislamiento de monocitos, provisto en el kit, al tubo de sangre. Perlas magnéticas de vórtice, también incluidas en el kit, durante 30 s, y añadir 2 mL al tubo de sangre.
- Si se dispone de menos de 40 mL de sangre, reduzca la cantidad de reactivos añadidos. Para mezclar la solución, pipetee hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 mL e incube durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Separe la mezcla de sangre en partes iguales en cuatro tubos de 50 mL y agregue 30 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) que contenga 1 mM de EDTA a cada tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 mL.
- Coloque los tubos en soportes magnéticos durante 10 minutos para extraer las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. Utilice cuatro soportes magnéticos simultáneamente, uno para cada tubo, para permitir tiempos de incubación y aislamiento consistentes para cada muestra de sangre.
- Extraiga el contenido desde el centro de cada tubo, con una pipeta, mientras aún están en los soportes magnéticos. Tenga cuidado de no extraer glóbulos rojos (no más del 10% del volumen inicial de 10 ml) y coloque el contenido en uno de los cuatro tubos nuevos de 50 ml.
- Agregue 500 μL de perlas magnéticas en vórtice a cada tubo de 50 mL. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 25 ml e incubar en RT durante 5 min. Luego, coloque los tubos en soportes magnéticos durante 5 minutos.
- Transfiera con cuidado el contenido desde el centro de cada tubo mientras aún está en los soportes magnéticos a uno de los cuatro tubos nuevos de 50 ml. Coloque directamente cada nuevo tubo de 50 ml en los soportes magnéticos durante 5 minutos.
- Transfiera cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo a uno de los cuatro tubos nuevos de 50 ml. Centrifuga todos los tubos nuevos de 50 ml a 300 x g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los cuatro gránulos celulares en un total de 10 mL de PBS estéril.
- Recuento de células por exclusión de azul de tripán utilizando un hemocitómetro.
NOTA: 8-20 x 106 células generalmente se obtienen de 40 mL de sangre entera.