Sistemas y componentes inmunológicos

En este video, demostramos el aislamiento de monocitos de sangre humana completa mediante separación inmunomagnética negativa. Los monocitos aislados se pueden utilizar para análisis posteriores.

En este video, demostramos el aislamiento de células de Kupffer o macrófagos hepáticos del hígado de ratón. El hígado se perfunde con una solución de digestión seguida de una separación en gradiente de densidad. Las células de Kupffer adherentes aisladas se pueden utilizar para análisis posteriores.

Este video muestra un protocolo libre de enzimas para aislar macrófagos del ganglio de la raíz dorsal del ratón (DRG) utilizando una técnica de disociación mecánica. Tras la homogeneización del tejido DRG recién recolectado, se utilizan anticuerpos contra los receptores de la superficie celular en los macrófagos para marcar las células con fluorescencia, seguido de la realización de citometría de flujo para confirmar la presencia de macrófagos en la muestra.

En este video, demostramos el aislamiento de linfocitos de un parche de Peyer de ratón cosechado. Los linfocitos aislados se pueden utilizar para análisis posteriores.

En este video, demostramos el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, PBMCs, que contienen monocitos y linfocitos de una capa de leucocitología humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los PBMC aislados se pueden utilizar para un análisis posterior.

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

En este video, demostramos el aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea a partir de huesos largos de ratones. Las BMSC adherentes aisladas se pueden utilizar para un análisis posterior.

Este video muestra el aislamiento de células T de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando la tecnología de clasificación de células activadas por flotación funcionalizada (BACS). La técnica de aislamiento consiste en la selección positiva de linfocitos T CD3+ mediante el marcaje de las células con anticuerpos anti-CD3 biotinilados y la separación de las células unidas a anticuerpos mediante microburbujas unidas a estreptavidina.

En este video, describimos un protocolo para la activación de células T primarias humanas. La incubación de linfocitos T vírgenes con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, seguida de un tratamiento con interleucina-2 o interleucina-15, conduce a la activación de los linfocitos T naïve y a su diferenciación y proliferación en linfocitos T efectores o de memoria.

En este video, demostramos el aislamiento de leucocitos hepáticos marginados del hígado de ratón por perfusión forzada.

Este video muestra el aislamiento de linfocitos, incluidas las células asesinas naturales o células NK, del tejido hepático humano para su expansión selectiva. La digestión enzimática y mecánica, seguida de la separación por gradiente de densidad, promueve el aislamiento de linfocitos, incluidas las células NK. Los linfocitos recolectados se pueden utilizar posteriormente para la expansión selectiva de las células NK.

Este video muestra una técnica para la expansión de células asesinas naturales (NK) directamente desde células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando una línea celular alimentadora. Las PBMC se cocultivan con células alimentadoras linfoblastoides modificadas genéticamente que expresan interleucina-21 unida a la membrana (mIL-21), y el cultivo se complementa con las citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). En conjunto, este cóctel de ligandos conduce a la...

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de las células de Sertoli de los túbulos seminíferos de ratón, un componente de los testículos. La digestión enzimática y los lavados repetidos promueven la liberación de células de Sertoli en la solución, que se pueden cultivar aún más para la proliferación y el crecimiento.

Este video muestra un protocolo para el aislamiento basado en marcaje magnético de una población de baja concentración de células T CD4 + Vδ1 + γδ de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Utilizando una combinación de anticuerpos anti-Vδ1 conjugados con FITC, microesferas magnéticas anti-FITC y perlas superparamagnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD4, las células T CD4 + Vδ1 + se pueden purificar con éxito a partir de la población de PBMC.

En este video, demostramos el aislamiento de neutrófilos citotóxicos de alta densidad y neutrófilos de baja densidad de la sangre de un ratón portador de tumores mediante centrifugación discontinua en gradiente de sacarosa.

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de la red de células inmunes gingivales a partir de un modelo de ratón. La digestión enzimática libera el tejido gingival de los dientes y el hueso adheridos, que se digiere mecánicamente, liberando células inmunitarias de la encía. Las células aisladas están listas para experimentos inmunológicos.

Este video muestra un método de lavado peritoneal para aislar mastocitos maduros de tipo tejido conectivo de la cavidad peritoneal de ratones adultos. Al aislar una mezcla de células inmunitarias primarias de la cavidad peritoneal, se realiza la proliferación selectiva de mastocitos en condiciones de cultivo adecuadas.

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Este video muestra el procedimiento de aislamiento quirúrgico del ganglio linfático de drenaje inguinal de un modelo de ratón. La incisión de la región abdominal proporciona acceso al ganglio linfático inguinal, que se extrae quirúrgicamente. El ganglio linfático inguinal translúcido recolectado se puede utilizar para estudios inmunológicos.

Este video muestra una técnica de disección para recolectar ganglios linfáticos poplíteos drenantes de las patas traseras del ratón. Los ganglios linfáticos desempeñan un papel fundamental en la creación de puentes entre la inmunidad innata y la adaptativa, y la recolección de ganglios linfáticos intactos, con una estructura de tejido preservada y viabilidad celular, puede ayudar a estudiar las respuestas inmunitarias locales y sistémicas.

Este video muestra el cebado de monocitos primarios en macrófagos. Los monocitos humanos primarios pueden aislarse y diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio similar a M1 utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) o a un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

Este video describe un método in vitro para generar macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). La generación de macrófagos a partir de iPSCs ocurre en tres etapas: (i) agregación de iPSCs en suspensión para formar cuerpos embrioides tridimensionales (EBs) que se diferencian en células mesodérmicas, (ii) formación de células precursoras de macrófagos a partir de las EBs diferenciadas, y (iii) diferenciación de las células precursoras de macrófagos en macrófagos...

En este video, demostramos un procedimiento para inducir la diferenciación y polarización de monocitos derivados de sangre periférica en macrófagos M1 o M2. La incubación con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, lipopolisacárido e interferón-gamma produce macrófagos M1 proinflamatorios, mientras que la incubación con factor estimulante de colonias de macrófagos e interleucina-4 induce la producción de macrófagos M2 antiinflamatorios.

Este video muestra un ensayo in vitro para generar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfoides comunes (CLPs). Al cocultivar CLPs purificadas con células alimentadoras irradiadas con γ en presencia de ligando (FL) de tirosina quinasa-3 similar a Fms, las CLP se diferencian en pDC no adherentes, cuya presencia se confirma mediante citometría de flujo.

Este video muestra la generación de células dendríticas inmaduras, maduras y tolerogénicas, o CD, a partir de monocitos humanos. La incubación de monocitos con factores de crecimiento y citocinas conduce a la producción de CD inmaduras. En respuesta a las moléculas inmunorreguladoras, las CD inmaduras se diferencian en CDs tolerogénicas y maduras.

Este vídeo demuestra la diferenciación de las células estromales de la médula ósea (BMSC) en adipocitos. En el proceso de dos pasos, en presencia de factores de crecimiento y hormonas específicas, las BMSC indiferenciadas primero se diferencian en preadipocitos. El segundo paso, que implica el tratamiento con glucosa e insulina, conduce a la formación de adipocitos maduros con múltiples gotas de lípidos.

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

En este vídeo, describimos un protocolo para purificar plaquetas de sangre total murina y su posterior activación con el agonista plaquetario trombina. Cuando se analizan con citometría de flujo, las plaquetas en reposo purificadas se caracterizan en función de la expresión de su marcador de superficie celular CD41, mientras que las plaquetas activadas purificadas coexpresan los marcadores de superficie CD41 y CD62P.

Este video muestra una técnica in vitro para generar y aislar trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos. Los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica y se estimulan con acetato de forbol miristato (PMA) para producir NET. Durante la incubación, los neutrófilos se someten a un proceso de muerte celular (NETosis) para liberar NETs que comprenden cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas granulares.

Este video demuestra la diferenciación in vitro del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos o de las células T auxiliares productoras de GM-CSF (THGM). Las células T vírgenes aisladas se estimulan para su diferenciación en THGM, lo que se confirma mediante la detección de una alta producción intracelular de GM-CSF y una baja expresión de otras citocinas específicas de las células T auxiliares.

Este video muestra un ensayo colorimétrico para determinar la actividad de degranulación de los mastocitos. La enzima liberada por los mastocitos hidroliza el sustrato y produce un producto coloreado. La actividad de degranulación de los mastocitos se midió como el porcentaje de liberación de enzimas fuera de la célula normalizado con el contenido total de enzimas en la célula.

En este video, describimos un protocolo para la clasificación basada en citometría de flujo de subpoblaciones de células B vírgenes, células B de memoria y células plasmáticas de plasmablastos a partir de células B de sangre periférica humana. Las diferentes subpoblaciones de células B se pueden distinguir en función de la unión de anticuerpos basados en fluoróforos a los receptores CD19, CD27 y CD38 expresados en las superficies de las células B, seguida de la clasificación de las células.

Este vídeo demuestra el uso del ensayo ELISpot para evaluar la función de los linfocitos B secretores de anticuerpos, ASCs. Los anticuerpos secretados por las ASC interactúan con los fragmentos de anticuerpos policlonales unidos a la membrana, que son detectados por los anticuerpos IgG o IgM conjugados con enzimas. La mancha de color producida en cada pocillo indica la presencia del isotipo del anticuerpo específico, que se correlaciona con la actividad secretora de las células B.

En este video, describimos un protocolo para aislar células individuales de ganglios linfáticos de drenaje pancreático murino (PDLN) y la caracterización de células T reguladoras (Tregs) de la población de células individuales utilizando citometría de flujo. Las Tregs se identifican en función de la expresión positiva de los marcadores de superficie celular CD4, CD25 y Nrp1, junto con los factores de transcripción nuclear Foxp3 y Helios.

Fuente: Bello-Gamboa, A. et al., Imaging the Human Immunological Synapse.J. Vis. Exp.(2019)
Este video muestra el estudio in vitro de la formación inmunológica de sinapsis entre una célula presentadora de antígenos y linfocitos T auxiliares utilizando un microscopio de fluorescencia. Los receptores de linfocitos T auxiliares interactúan con un complejo antígeno-MHC-II en las células presentadoras de antígenos y forman sinapsis inmunológicas, seguidas de movimientos de vesículas secretoras...

En este video, demostramos una técnica basada en citometría de flujo para determinar la proporción de células T asesinas inducidas por citocinas, células CIK, expandidas a partir de un cultivo de células mononucleares de sangre periférica.

Este video muestra un método de imagen para visualizar in situ la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) en el bazo del ratón. Después de la infección bacteriana y la inducción de la acumulación de IFN-γ dentro de las células T y las células asesinas naturales, el bazo se extrae del ratón. Al obtener secciones de tejido, se realiza una inmunotinción para visualizar el IFN-γ dentro de las células.

En este video, describimos un protocolo para la inmunotinción y la visualización basada en microscopía confocal de trampas extracelulares (MET) de macrófagos en tejido pulmonar murino. Los macrófagos residentes en los tejidos se caracterizan por la expresión del marcador de glicoproteína de superficie F4/80 específico de macrófagos, mientras que los MET se visualizan marcando los marcadores MET metaloproteinasa 9 de la matriz, la histona H3 citrulinada y la cromatina extracelular.

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Este video demuestra la visualización de linfocitos intraepiteliales γδ (IELs) en ratones transgénicos utilizando microscopía confocal. El procedimiento quirúrgico consiste en crear una línea de perforación y hacer una incisión longitudinal para exponer la mucosa intestinal y las vellosidades. Los ratones transgénicos expresan proteínas reporteras exclusivamente en γδ IELs, lo que permite su seguimiento. Las imágenes intravitales capturan el movimiento dinámico de las IAL γδ marcadas con...

Este video muestra la generación y el aislamiento de micropartículas derivadas de linfocitos T, LMP, a partir de linfocitos T después del tratamiento con actinomicina-D.

Este video describe un protocolo para aislar células T CD8+ específicas de antígenos raros utilizando células presentadoras de antígenos artificiales (aAPCs) basadas en nanopartículas magnéticas funcionalizadas con MHC-Igs cargadas de péptidos antigénicos y anticuerpos anti-CD28. La interacción de las aAPC con los linfocitos T CD8+ que expresan específicamente los receptores de linfocitos T dirigidos a péptidos antigénicos, seguida de su expansión in vitro, da como resultado el enriquecimiento...

Este video muestra cómo separar los neutrófilos de las secreciones traqueales utilizando un dispositivo microfluídico con canales en espiral. El dispositivo logra una separación eficiente basada en el tamaño de la celda mediante la utilización de diferentes espesores y canales de forma trapezoidal. La interacción entre las fuerzas da como resultado que los neutrófilos grandes se acumulen cerca de la pared interna, mientras que los eritrocitos y los agregados de mucina permanecen cerca de la...

En este video, demostramos el radiomarcaje intracelular de células T auxiliares utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con isótopos radiactivos para imágenes de tomografía por emisión de positrones no invasivas.