Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento y cultivo de PMC por lavado intraperitoneal
- Aislamiento de PMC por lavado intraperitoneal
- Antes del aislamiento de la celda, prepare los materiales enumerados en la Tabla 1.
- Utilice ratones machos de 8 a 14 semanas de edad para el aislamiento de PMC. Eutanasia a un ratón por inhalación de CO2 y confirmar la muerte por pérdida de reflejos. Rocíe el ratón con etanol al 70% y fíjelo en un bloque de espuma con alfileres (con el lado dorsal hacia abajo). Retire la piel ventral del ratón con unas tijeras de borde romo. Evite dañar la cavidad peritoneal.
nota: Por lo general, utilizamos este protocolo para ratones con un fondo genético de cepa C57BL/6N.
- Inyecte 7 mL del medio RPMI helado y 5 ml de aire en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja de 27 G. Empuje la aguja con cuidado en el peritoneo y no perfore ningún órgano. Use un punto en la región de la grasa del epidídimo para reducir el riesgo de perforación del órgano.
- Después de la inyección, agite el ratón durante 1 minuto para separar las células peritoneales en el medio RPMI. No agite el ratón con demasiada fuerza, para evitar dañar los órganos internos y contaminar la cavidad peritoneal con la sangre.
- Reutilice la jeringa de 10 ml equipándola con una nueva cánula de 20 G. Mueva los órganos internos hacia un lado inclinando el bloque de espuma y golpeándolo suavemente en el banco para facilitar la aspiración media desde el otro lado. Inserte una aguja de 20 G, biselela y aspire el líquido del abdomen suave y lentamente (~0,5 mL/s) para evitar la obstrucción de los órganos internos. Recoja la mayor cantidad de líquido posible (por lo general, de 5 a 6 ml).
- Retire la aguja de la jeringa y transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo de recolección en hielo. Deseche un tubo de muestra si hay contaminación sanguínea visible.
- Centrifugar los tubos con la suspensión celular a ~300 x g durante 5 min. Bajo una campana estéril aspirar el sobrenadante. Para cada ratón, combine los gránulos de muestra en 4 ml de medio PMC frío (4-10 °C) y transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo de25 cm2. Agregue los factores de crecimiento IL-3 y SCF a las concentraciones finales de 10 ng/mL y 30 ng/mL, respectivamente. Coloque el matraz que contiene las células en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) e incube durante ~48 h hasta el siguiente procedimiento.
- Cultura PMC
- Día 2 (~48 h después del aislamiento): Cambio de medio
- Para eliminar las células sobrenadantes y no adherentes (eritrocitos y células muertas), aspire el medio del matraz colocando una punta de pipeta Pasteur en el borde del matraz y sujetando el matraz casi horizontalmente. Agregue 4 ml de PMC Medium precalentado por mouse. Agregue los factores de crecimiento IL-3 (10 ng/mL) y SCF (30 ng/mL). Colocar el matraz que contiene las células en una incubadora (37 °C y 5% de CO2).
- Día 9: División de células
- Transfiera la suspensión celular del matraz de cultivo celular a un tubo de centrífuga de plástico de 50 mL. Lave el matraz tres veces con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) precalentada (37 °C) de Dulbecco, recogiendo la suspensión celular con las celdas separadas en el mismo tubo de centrífuga de plástico de 50 mL. Cuente la concentración de células con un hemocitómetro y calcule el número total de células.
- Centrifugar la suspensión celular a ~300 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Recupere el pellet en medio PMC precalentado (37 °C) para obtener la concentración de celdas 1 x 106 celdas/mL. Transfiera la suspensión celular a un nuevo matraz de cultivo de 25cm2. Deseche el matraz viejo con fibroblastos adheridos al fondo.
- Añadir los factores de crecimiento IL-3 (10 ng/mL) y SCF (30 ng/mL), y colocar el matraz que contiene las células en una incubadora (37 °C y 5% CO2).
- Días 12 a 15: Mediciones de células
- Si se planea algún experimento con la estimulación de los receptores FcɛRI, se deben tratar previamente las células durante la noche con 300 ng/mL de IgE anti-DNP en un medio de cultivo estándar.
>2. Medición de la liberación de beta-hexosaminidasa en PMC
- Antes de las mediciones, prepare los materiales enumerados en la Tabla 2.
NOTA: La β-hexosaminidasa liberada por los MC después de su estimulación hidroliza la p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) en p-nitrofenol y N-acetil-D-glucosamina. La cantidad de β-hexosaminidasa en la muestra es proporcional a la cantidad de p-nitrofenol que se formará. En un entorno de pH alto de "Stop Solution", el p-nitrofenol existe como p-nitrofenolato totalmente desprotonado y puede detectarse por su absorbancia de luz a 405 nm.
- Prepare la solución de Tyrode que contiene 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,4 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 5,6 mM de glucosa y BSA 0,1%. Ajuste el pH a 7,4 con 3 M de NaOH.
- Prepare la solución de lisis añadiendo un volumen del 1% de Triton X-100 a la solución del Tyrode.
- Prepare la solución de parada compuesta por 200 mM de glicina y ajuste el pH a 10,7 con NaOH.
- Prepare la solución de pNAG (4-nitrofenil 2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopiranósido) disolviendo pNAG en ácido cítrico 0,4 M hasta una concentración final de 4 mM.
- Calcule la cantidad de células necesarias para el ensayo (realice el ensayo por duplicado). Utilice 200.000 PMC por pozo. Utilice 2 pocillos como controles negativos (solución de Tyrode sin secretagogos como DNP o compuesto 48/80) y 2 pocillos como controles positivos (solución de Tyrode con 10 μM de ionomicina) para cada genotipo.
- Transfiera las células a un tubo de centrífuga de plástico de 15 mL, ajuste el volumen a 15 mL con la solución de Tyrode y centrifugue a 200 x g durante 4 min. Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur y vuelva a suspender las células en la solución de Tyrode a 2 x 106 células/mL.
- Transfiera 100 μL de la suspensión de celda por pocillo a una placa de pocillo de fondo en V de 96 pocillos. Agregue 25 μL de solución de estimulación o de control a cada pocillo (de acuerdo con el esquema de pipeteo ilustrado en la Figura 1A). Incubar las células durante 45 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Detenga la reacción colocando la placa de 96 pocillos en hielo durante 5 minutos. A continuación, centrifugar la placa a 4 °C durante 4 min a 120 x g. Transfiera 120 μL del sobrenadante con una pipeta multicanal a una placa de fondo plano de 96 pocillos y colóquela en hielo. Evite cuidadosamente tocar los gránulos de celdas, pero aspire completamente el sobrenadante.
- Añada 125 μL de tampón de lisis a los gránulos de celdas. Incubar los gránulos celulares durante 5 min a temperatura ambiente y volver a suspenderlos después de la incubación mediante pipeteo repetido (aproximadamente 5 veces).
- Pipetear 25 μL de la solución pNAG (4 mM) en los pocillos necesarios de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Añadir 25 μL de cada sobrenadante a la solución de pNAG preparada, así como 25 μL de cada lisado celular.
- Incubar los lotes de reacción durante 1 h a 37 °C. Después de la incubación, pipetear 150 μL de solución de parada en cada pocillo para detener la reacción.
- Analice la placa con un lector de microplacas utilizando un ajuste de longitud de onda dual a 405 nm con referencia de 630 nm para la sustracción automática del fondo. En el programa de adquisición, marque la casilla "Referencia" y en el menú de elementos del programa "Absorbancia", seleccione "630 nm" en la lista desplegable. Si la densidad óptica de las muestras es demasiado alta, prepare una dilución adecuada de la sonda antes de volver a medir.
Tabla 1: Materiales para el Paso 1.
| 1 | hielo |
| número arábigo | Jeringas de 10 mL |
| 3 | Agujas de 27 g |
| 4 | Agujas de 20 g |
| 5 | Bloque y pasadores de espuma de poliestireno |
| 6 | Tubos de recolección (tubos de centrífuga de plástico de 50 mL) |
| 7 | 70% etanol |
| 8 | RPMI Medio (Pre enfriado y mantenido en hielo) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medio + 20% FCS (Suero Fetal de Ternero) + 1% Penicilina Solución de estreptomicina (Pen-Strep) |
| 10 | Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco - DPBS (sin Ca2+ y Mg2+) |
| 11 | Frascos de cultivo (25 cm) |
| 12 | Factores de crecimiento soluciones madre (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipetas serológicas (10 mL) |
| 14 | Puntas de pipeta estériles (20–200 μL) |
| 15 | Hemotómetro |
| 16 | Centrífuga de sobremesa |
| 17 | Tijeras y pinzas |
| 18 | Cámara de CO2 para ratones |
| 19 | Campana estéril abierta |
| 20 | Campana estéril cerrada |
| 21 | Incubadora de células (37 °C y 5% de CO2) |
| 22 | Pipetas de transferencia (20–200 μL) |
Tabla 2: Materiales para el Paso 2.
| 1 | PMC (12–15 días de edad) 1 x 106 células/mL |
| número arábigo | Solución madre anti-DNP-Anticuerpo (IgE) |
| 3 | Solución de stock DNP-HSA |
| 4 | Solución madre compuesta 48/80 |
| 5 | Ionomicina |
| 6 | Placa de 96 pocillos, fondo en forma de V |
| 7 | Placas de 96 pocillos, fondo plano |
| 8 | Tubos de centrífuga de plástico (15 mL) |
| 9 | Pipetas serológicas |
| 10 | Incubadora de células (37 °C y 5% de CO2) |
| 11 | Centrífuga de sobremesa |
| 12 | Lector de placas de microtitulación para mediciones de densidad óptica |
| 13 | Pipeta multicanal (20–200 μL) |
| 14 | Hemotómetro |
