Aislamiento y cultivo de células de Kupffer de ratón

Resumen

Fuente: Bourgognon, M., et al. Aislamiento de células de Kupffer para pruebas de toxicidad de nanopartículas. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos el aislamiento de células de Kupffer o macrófagos hepáticos del hígado de ratón. El hígado se perfunde con una solución de digestión seguida de una separación en gradiente de densidad. Las células de Kupffer adherentes aisladas se pueden utilizar para análisis posteriores.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Perfusión y recolección de células (Figura 1)

1. Prepare de nuevo todos los reactivos descritos en la tabla de materiales.
2. Calentar la solución EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol)/HBSS (solución salina equilibrada de Hank) (50 ml por ratón) y la solución de colagenasa (100 ml por ratón) durante 30 min a 40 °C.
3. Enjuague primero el tubo flexible de la bomba con etanol al 70%. Vierta 40 ml de solución EGTA/HBSS en un tubo de centrífuga sumergido en el baño de agua y enjuague el tubo flexible de la bomba con solución EGTA/HBSS precalentada.
4. Realizar la anestesia terminal utilizando un barbitúrico para producir de forma fiable la inconsciencia antes de la depresión respiratoria y la muerte. Inyectar fenobarbitona a 1 mg/kg, i.p. en un ratón CD1 hembra o macho (35-45 g). Confirme la anestesia mediante un pellizco de los dedos de los pies.
5. Afeitar el vello abdominal y esterilizar la superficie abdominal con una solución de etanol al 70%.
6. Corta a través de la cavidad abdominal y expone la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente hacia la izquierda del abdomen.
7. Ponga en marcha la bomba a una velocidad de 1-3 ml/min con la solución EGTA/HBSS y canule la vena porta con una aguja de mariposa de 23 g (corte de alas). Pinza la sección de la vena porta canulada con la aguja de 23 G y luego voltee las pinzas de serrefine en la superficie del abdomen del ratón abierto. El hígado debe palidecer rápidamente dentro de los primeros 30 segundos de perfusión de la solución de EGTA/HBSS.
8. Incidir rápidamente la parte inferior de la vena cava inferior para evitar la acumulación de un exceso de presión en el hígado y, a continuación, aumentar el caudal gradualmente hasta 7 ml/min, durante el primer minuto de perfusión. El animal muere debido a una hemorragia secundaria a la venopunción de la vena cava.
9. Cuando queden menos de 5 ml de solución de EGTA/HBSS en el tubo de centrífuga, llénelo con solución de colagenasa (40-50 ml). Aumente el caudal gradualmente a 10 ml/min, durante 30 segundos.
10. Haga que el hígado se hinche aplicando presión en la vena cava inferior, con pinzas, durante intervalos de 5 a 10 segundos. Esto se puede hacer periódicamente (5-10 veces durante la digestión). Este paso mejorará la disociación de las células hepáticas y reducirá el tiempo de perfusión con colagenasa.
11. Cuando queden menos de 10 ml de solución de colagenasa dentro del tubo de centrífuga, vierta 40-50 ml de solución de colagenasa precalentada en el tubo de centrífuga.
12. Después de 10-15 min de perfusión y unos 70-80 ml de solución de colagenasa perfundidos, aplique una pequeña presión sobre la superficie del hígado con una pinza. Una impresión de la presión indica que las células hepáticas están disociadas.
13. Extraiga el hígado de la cavidad abdominal en una sola pieza y colóquelo en un tubo de centrífuga que contenga 20-30 ml de medio de aislamiento de células de Kupffer. Mantenga las células hepáticas en hielo o a 4 °C durante un período máximo de 3 horas para evitar afectar la viabilidad de las células hepáticas.
14. Repita el procedimiento de perfusión en varios animales si es necesario, mientras mantiene el hígado perfundido en hielo. Agrupe de uno a tres hígados para la purificación y continúe con la etapa 3.

>2. Preparación del gradiente de densidad para la centrifugación (Figura 2)

1. Proceda con los siguientes pasos (secciones 2, 3 y 5) en condiciones estériles y mantenga las células en hielo o a 4 °C. Prepare la SIP (Solución de Partículas de Sílice Recubiertas Isotónicas) mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice recubierta con 1,7 ml de 10 x PBS.
2. Para hacer 20 ml de solución de SIP al 25%, mezcle 5 ml de SIP con 15 ml de PBS. Para preparar 20 ml de solución SIP al 50%, mezcle 10 ml de SIP con 10 ml de PBS.
3. Llene un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución SIP al 50%. Incline el tubo de centrífuga en un ángulo cercano a 90° y agregue lentamente la solución SIP al 25% (20 ml) en la pared lateral del tubo con una pipeta serológica de 25 ml, sin tocar la superficie de la capa SIP al 50%. Al agregar la solución SIP al 25%, reduzca progresivamente el ángulo del tubo. Mantenga el gradiente de densidad en hielo hasta su uso.

>3. Purificación de células de Kupffer (Figura 3)

1. Coloque un hígado perfundido en una placa de Petri con 15 ml de medio de aislamiento celular de Kupffer. Rompa la cápsula de Glisson (membrana del hígado) con unas tijeras y libere todas las células hepáticas en el medio de aislamiento de células de Kupffer. Filtrar la solución a través de un colador de células de 100 μm para recogerla en un tubo de centrífuga. Repita el procedimiento de perfusión en hígados perfundidos adicionales y agrupe las células en el mismo tubo de centrífuga (15 ml de un ratón y hasta 45 ml de tres ratones).
2. Centrifugar la suspensión celular a 50 x g durante 2 min a 4 °C. Las células parenquimatosas (hepatocitos) estarán en el pellet y las células no parenquimatosas (incluidas las células de Kupffer) estarán en el sobrenadante.
3. Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugue a 50 x g durante 2 minutos cada uno. Repita este paso tres veces más.
4. Centrifugar a 1.350 x g durante 15 min para pelletizar células no parenquimatosas. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de aislamiento celular de Kupffer.
5. Añadir la solución de células no parenquimatosas en el gradiente isotónico discontinuo 25/50% como se describe en el punto 2.3. Centrifugar a 850 x g durante 15 min sin aceleración ni pausa.
6. Localice la fracción de células de Kupffer enriquecidas que aparecen turbias dentro de la fracción SIP del 25% cerca de la interfaz SIP del 25/50% (Figura 3). Con una pipeta serológica de 10 ml, aspire unos 12 ml de la fracción de células de Kupffer enriquecida. Transfiera las células a un tubo de centrífuga que contenga 35-40 ml de medio de aislamiento celular de Kupffer. Mezclar suavemente y centrifugar a 1.350 x g durante 15 min a 4 °C para pellets de celdas.
7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5-10 ml de medio de cultivo celular Kupffer precalentado. Recuento de células (hemocitómetro) y medición de la viabilidad mediante tinción con azul de tripán.
8. Coloque las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos con una densidad de 5 x 10⁵ células/pocillo. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ (Figura 3). Después de 30 minutos, retire suavemente el medio, lávese con la solución salina equilibrada de Hank's (HBSS) precalentada una vez y luego reemplácelo con 500 μl de medio de cultivo celular Kupffer fresco y precalentado (por pocillo).

Resultados

Figura 1: Perfusión hepática. Después de la anestesia del ratón, el tracto digestivo se mueve lateralmente hacia la izquierda del abdomen para hacer accesible la vena porta (VP). La PV se canulada utilizando un caudal lento (1-3 ml/min) de solución de EGTA/HBSS y la vena cava inferior (IVC) se rompe inmediatamente para evitar cualquier exceso de presión dentro del hígado. En el primer minuto de perfu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Euthatal (pentobarbital sódico)	Merial
Ratones CD1	Río Charles	-	El peso del ratón debe variar de 35 a 45 g. Aconsejamos el uso de ratones machos CD1 ya que su peso aumenta rápidamente (por ejemplo, un ratón macho CD1 de 7 semanas de edad supera los 35 g de peso). También se aconseja ponerse en contacto con el proveedor de animales con antelación para organizar la entrega de los animales mayores. Alternativamente, los animales pueden estar en casa para alcanzar el peso deseado.
HBSS (libre de Ca2+ y Mg2+, con bicarbonato)	Tecnologías de la Vida	14175-053	HBSS debe estar libre de Ca2+.
Sal tetrasódica de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	También se puede utilizar EDTA, pero EGTA tiene la ventaja de quelar Ca2+ de forma selectiva.
HECTÁREAS (1M)	Tecnologías de la Vida	15630-056	100 ml
Colagenasa tipo IV	Worthington	CSL-4	Se aconseja probar diferentes lotes de colagenasa o al menos mencionar al proveedor que el producto tiene que ser adecuado para el aislamiento de células hepáticas
DMEM de glucosa baja	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (con piruvato de sodio y Glutamax®)	Tecnologías de la Vida	12633-012	500 ml
Penicilina/Steptomycin	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122	100 ml
Suero Fetal Bovino	Primer enlace	60-00-850	500 ml
Solución de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Solución de partículas de sílice recubierta (Percoll®)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® es muy estable y se puede conservar durante varios años
1x solución salina tamponada con fosfato	Tecnologías de la Vida	10010-023	500 ml
10x solución salina tamponada con fosfato	Tecnologías de la Vida	70011-036	500 ml
Juego de recolección de sangre de mariposa (tubo de 23 G/305 mm de largo)	Bd	367288
Filtros de jeringa (borde azul de 0,22 μm)	Minisart	16534-K
Tubos de centrífuga (50 ml Blue Cap)	BD Biociencias, Halcón	35 2070
Placa de Petri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
Filtro de células de 100 μm	Bd	352360
Bomba peristáltica	Watson Marlow	SciQ 300	Enjuague los tubos antes y después de cada uso con PBS estéril y etanol al 70%.
Placas de 24 pocillos	Corning	3526
centrífuga	Eppendorf	5810R
Pinzas Serrefine	Hammacher GmbH	N.º de art. HSE 004-35 / N.º de cat. 221-0051	Las pinzas serrefine permiten sujetar el vaso canulado con la aguja 23G sin necesidad de sujetar las pinzas durante el procedimiento de perfusión. Dirección URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Raspador de células	BD Biociencias, Halcón	353086	Corte las extremidades de la hoja con un par de tijeras para raspar las células en placas de 24 pocillos.
Solución EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol)/HBSS (solución salina equilibrada de Hank)			HBSS que contiene 0,5 mM de EGTA y 25 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Prepare 50 ml para cada hígado para perfundir.
Solución de colagenasa			DMEM bajo en glucosa que contiene colagenasa tipo IV a 100 UI/ml, 15 mM HEPES y 1% de penicllina/estreptamicina (v/v). Ajuste el pH a 7.4. Prepare 100 ml para cada hígado para perfundir. Después de agregar la colagenasa, se recomienda calentar la solución durante 30 minutos antes de usarla. Esto permite que la actividad de la colagenasa sea óptima.
Medio de aislamiento de células Kupffer			RPMI que contiene, 1% de aminoácidos no esenciales (v/v), 1% glutamax® (v/v) y 1% de penicllina/estreptomicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados.
Medio de cultivo celular Kupffer			RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino, 1% de aminoácidos no esenciales (v/v), 1% de Glutamax® (v/v) y 1% de penicllin/estreptamicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados.
SIP (solución de partículas de sílice recubiertas de isotónico)			Mezcle 1,7 ml de solución salina tamponada con fosfato 10x con 15,3 ml de Percoll® para obtener 17 ml de SIP.
Solución SIP al 25%			Mezclar 5 ml de SIP con 15 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato
Solución 50% SIP			Mezclar 10 ml de SIP con 10 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato
Tampón de lisis			Medios DMEM con 0,9% Triton X-100
Solución PBS/BSA			Prepare solución salina fresca tamponada con fosfato pH 7.4 con 1% de albúmina sérica bovina.