Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en macrófagos

Resumen

Fuente: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Producción y Caracterización de Macrófagos Humanos a partir de Células Madre Pluripotentes. J. Vis. Exp. (2020).

Este video describe un método in vitro para generar macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). La generación de macrófagos a partir de iPSCs ocurre en tres etapas: (i) agregación de iPSCs en suspensión para formar cuerpos embrioides tridimensionales (EBs) que se diferencian en células mesodérmicas, (ii) formación de células precursoras de macrófagos a partir de las EBs diferenciadas, y (iii) diferenciación de las células precursoras de macrófagos en macrófagos maduros y funcionales.

Protocolo

1. Diferenciación de iPSC humanos a macrófagos

NOTA: En la Figura 1 se muestra un resumen esquemático del protocolo de diferenciación de macrófagos.

1. Preparación de diferenciación celular, factores de crecimiento y otros reactivos
   1. Preparación de medios libres de suero de células madre embrionarias humanas (hESC-SFM; ver Tabla de Materiales) complementando el medio Eagle modificado-F12 (DMEM/F12) de Dulbecco con suplemento de hESC, 1,8% p/v de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,1 mM 2-mercaptoetanol.
   2. Prepare una solución al 0,1% p/v de gelatina porcina disolviendo la gelatina en agua estéril. La solución de gelatina puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 años.
   3. Prepare la solución madre de proteína morfogenética ósea humana (BMP4) (25 μg/mL) disolviendo BMP4 en una solución de PBS BSA de cloruro de hidrógeno (HCl) al 0,2% de 4 mM. Distribuya la solución madre como alícuotas de 50 μL en criotubos. Las soluciones madre pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año. Una vez descongelado, el stock BMP4 puede almacenarse a 4 °C durante 5 días.
   4. Prepare una solución madre de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano (100 μg/mL) disolviendo VEGF en una solución de PBS BSA al 0,2%. Distribuya la solución madre como alícuotas de 10 μL en criotubos. Las soluciones madre pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año. Una vez descongelado, el VEGF en stock puede almacenarse a 4 °C durante 7 días.
   5. Prepare la solución madre del factor de células madre humanas (SCF) (100 μg/mL) disolviendo el SCF en una solución de PBS BSA al 0,2%. Distribuya la solución madre como alícuotas de 5 μL en criotubos. Las soluciones madre pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año. Una vez descongelado, el material SCF puede almacenarse a 4 °C durante 10 días.
   6. Prepare la solución madre de interleucina-3 (IL3) humana (10 μg/mL) disolviendo IL3 en una solución de PBS BSA al 0,2%. Distribuya la solución madre como alícuotas de 500 μL en criotubos. Las soluciones madre pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 2 años. Una vez descongelado, el caldo de IL3 puede almacenarse a 4 °C durante 15 días.
   7. Prepare una solución madre de factor estimulante de colonias (CSF1) de macrófagos humanos (10 μg/mL) disolviendo CSF1 en una solución de PBS BSA al 0,2%. Distribuya la solución madre como alícuotas de 1 mL en criotubos. Las soluciones madre pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 2 años. Una vez descongelado, el stock CSF1 puede almacenarse a 4 °C durante 15 días.
2. Etapa 1: Generación de cuerpos embrioides (día 0-día 3)
   1. En el día 0, agregue 2,25 mL de medios de la Etapa 1 (hESC-SFM suplementado con 50 ng/mL de BMP4, 50 ng/mL de VEGF y 20 ng/mL de SCF) en dos pocillos de una placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja.
   2. Reemplace los medios de mantenimiento de un pocillo confluente al 80 % de iPSC en una placa de 6 pocillos con 1,5 mL de medios de la Etapa 1.
   3. Corte las colonias con la herramienta de paso de celdas y transfiera las colonias cortadas con una pipeta a los dos pocillos de una placa de 6 pocillos con accesorio ultrabajo (consulte la Tabla de materiales).
   4. En el día 2, lleve las citocinas a una concentración final de 50 ng/mL de BMP4, 50 ng/mL de VEGF y 20 ng/mL de SCF utilizando 0,5 mL de medio hESC-SFM.
      nota: Las colonias de IPSC se convertirán en EB (Figura 2A).
3. Etapa 2: Emergencia de células hematopoyéticas en suspensión
   1. El día 4, cubra 4 pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos con gelatina al 0,1% p/v e incube durante al menos 10 minutos.
   2. Retire la gelatina y agregue 2,5 mL de medio de la Etapa 2 (X-VIVO15 suplementado con 100 ng/mL de CSF1, 25 ng/mL de IL-3, 2 mM de glutamax, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,055 mM de 2-mercaptoetanol).
   3. Recoja los EB formados en un tubo de centrífuga de 50 ml y deje que se depositen en el fondo del tubo por gravedad. Aspire cuidadosamente los medios.
   4. Vuelva a suspender los EB en 2 mL de medios de la etapa 2.
   5. Transfiera de 10 a 15 EB (no más de 15) a un pocillo recubierto de gelatina que contenga 2,5 mL de medios de la Etapa 2.
   6. Incubar los EB a 37 °C y 5% de_CO2 en el aire.
   7. Cambie los medios de los EB plateados cada 3 a 4 días durante 2 a 3 semanas.
   8. Después de 2-3 semanas, las EB comienzan a liberar células hematopoyéticas no adherentes en suspensión.
      nota: Este período de liberación de la célula de suspensión puede variar y depende de la línea celular. Las células de esta suspensión pueden cosecharse y madurarse hasta convertirse en macrófagos (véase la Etapa 3) (Figura 2A).
4. Etapa 3: Maduración terminal de macrófagos
   1. Recoja las células hematopoyéticas en suspensión y reponga los medios (medios de la etapa 2) en la placa EB.
   2. Centrifugar las celdas de suspensión a 200 x g durante 3 min.
   3. Resuspender las células en suspensión en medios de la Etapa 3 (X-VIVO15 suplementado con 100 ng/mL de CSF1, 2 mM de glutamax y 1% de penicilina-estreptomicina).
   4. Placa recolectada e hilada de células en placas de plástico de 10 cm de grado bacteriológico sin tratar (10 mL) o placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos sin recubrimiento (3 mL) a una densidad de 0,2 x 10⁶ células/mL.
   5. Mantenga las células en el medio de la Etapa 3 durante 9 a 11 días, cambiando el medio cada 5 días.
      nota: Los pasos 1.4.1-1.4.5 de la Etapa 3 se pueden repetir cada 3-4 días y las células en suspensión se pueden recolectar de la placa EB original hasta por 3 meses.

Resultados

Figura 1: Resumen gráfico de la diferenciación de iPSC a macrófagos funcionales maduros. Diagrama dibujado con Biorender.

Figura 2: Diferenciación de iPSC hacia macrófagos y número y morfología de iPSC-DM. (A) Imágenes de campo claro o...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CellMask Tinción de membrana plasmática de color rojo intenso	Termopescador	C10046	Medios de criopreservación
Criostor CS10	sigma	C2874
Sustrato CTS CELLstart	Invitrogen	A1014201	Sustrato de células madre
Gelatina de piel de cerdo	sigma	G9136
Proteína BMP4 humana recombinante	I+d	314-BP-010
IL3 humana recombinante	Preprotech	0200-03-10
MCSF humano recombinante (sin portadores) 100ug	Bioleyenda	574806
Proteína VEGF humana recombinante	I+d	293-VE-010
Proteína humana recombinante SCF (C-Kit Ligando)	Termopescador	PHC2111
StemPro hESC SFM	Termopescador	A1000701
StemPro EZPassage Herramienta de paso de células madre desechables	Termopescador	23181010
Placas de fijación ultrabajas: placa de pocillos múltiples de cultivo celular, 6 pocillos, superficie repelente de células estelares celulares	Greiner	657970
2-Mercaptoetanol (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, calcio, magnesio (500ml)	Termopescador	14040091
Suplemento GlutaMAX	Termopescador	35050061