Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Recolectar DRG lumbar de ratones experimentales
- Antes de comenzar el experimento, prepare la solución de trabajo del medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll) mezclando 9 volúmenes del medio con 1 volumen de HBSS 10x libre de Ca++/Mg++. Manténgalo en hielo.
- Anestesiar el ratón con 2.5% de Avertin. Confirmar que el animal está completamente anestesiado por la falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
NOTA: Se utilizaron ratones machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad.
- Perfundir el ratón por vía transcárdica con 10 ml de PBS 1x preenfriado.
- Coloque el ratón en posición supina con cuatro patas aseguradas con la cinta dentro de una campana de gases químicos. Levante la piel por debajo de la caja torácica con las pinzas y haga una pequeña incisión con unas tijeras quirúrgicas para exponer el hígado y el diafragma.
- Continúe usando tijeras para cortar el diafragma y la caja torácica, y abra la cavidad pleural para exponer el corazón que late.
- Corta rápidamente el apéndice auricular derecho con unas tijeras para iris. Una vez que se note el sangrado, inserte una aguja de 30 G en el extremo posterior del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10 mL de PBS 1x preenfriado para perfundir al animal.
- Realizar laminectomía dorsal en el ratón colocado en posición prona.
nota: Si se planea un cultivo celular, rocíe el ratón con etanol al 70% antes de la incisión y use instrumentos quirúrgicos preesterilizados para la disección.
- Use un bisturí de tamaño 11 para hacer una incisión lateral profunda longitudinal desde la región torácica hasta la región sacra. Retire la piel con las tijeras para exponer la capa muscular dorsal.
- Use Friedman-Pearson Rongeur para despegar los tejidos conectivos y los músculos hasta que las apófisis lumbosacras de la columna vertebral y las apófisis transversas bilaterales queden expuestas.
- Use una tijera de resorte Noyes para abrir cuidadosamente la columna vertebral dorsal, luego cambie a un Friedman-Pearson Rongeur para extirpar los huesos vertebrales y exponer la médula espinal con los nervios espinales intactos unidos.
- Diseccionar cuidadosamente el DRG lumbar ipsilateral y contralateral (L4/L5 DRG en nuestro estudio) y colocarlo en 1 mL de HBSS 1x libre de Ca++/Mg++ frío como hielo en un homogeneizador de tejidos Dounce. Ahora los pañuelos están listos para el paso 2.
nota: Si es posible, recorte el nervio espinal unido al DRG.
>2. Aislar células individuales de DRG lumbar de ratón
- Homogeneizar el tejido DRG con un mortero suelto en el homogeneizador Dounce 20-25 veces.
- Coloque un colador de células de nailon estéril de 70 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml. Humedece el filtro de células con 800 μL de HBSS 1x helado y el flujo se recoge en el tubo cónico.
- Recoja la suspensión de tejido homogeneizado del homogeneizador con una pipeta y pásela a través del filtro de células de nailon húmedo de 70 μm al tubo cónico de 50 mL.
- Enjuague el homogeneizador dos veces con 800 μL de HBSS 1x helado y luego decántelo en el mismo tubo cónico de 50 mL con un filtro de celdas para aumentar el rendimiento.
- Añada 1,5 mL de medio de gradiente de densidad isotónica equilibrado y frío (preparado en el paso 1.1) en un tubo estéril de poliestireno FACS de 5 mL.
- Transfiera el homogeneizado celular del tubo cónico de 50 mL (en el paso 2.4) al tubo FACS y mezcle bien con el medio de gradiente de densidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Agregue 500 μL adicionales de 1x HBSS para sellar la parte superior.
- Granular las células por centrifugación a 800 x g durante 20 min a 4 °C.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante que contiene mielina en el medio sin alterar la pastilla celular en el fondo del tubo FACS.
- Vuelva a suspender las células en tampón PBS o FACS que contenga un 5% de suero fetal bovino (FBS) para el análisis de FACS.
nota: Se esperan al menos de 50.000 a 100.000 celdas del DRG L4 /L5 de un ratón.
- Vuelva a suspender las células DRG aisladas mecánicamente (L4/L5) en 100 μL de PBS que contengan un 5% de suero fetal bovino y, a continuación, incube con el anticuerpo CX3CR1-APC de ratón α (1:2.000) en la oscuridad a 4 °C durante 1 h.
- Lave las células con 5 ml de PBS una vez; centrifugue las células 360 x g durante 8 minutos a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspender la pastilla celular en 300 μL de PBS para el análisis de FCAS. Si se planea la ordenación de celdas, vuelva a suspender las celdas en el búfer FACS en su lugar.