Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos:
- Extirpación quirúrgica del intestino delgado (IS)
- Eutanasia de ratones mediante asfixia con CO2 o cualquier método equivalente aprobado por el comité institucional de ética animal.
- Transfiera el mouse a un área dedicada para la escisión quirúrgica. Coloque la parte trasera hacia abajo y desinfecte el abdomen con etanol al 70%. Realizar una laparotomía cortando la piel abdominal y el peritoneo a lo largo de la línea media desde el pubis hasta la caja torácica, abriendo así la cavidad peritoneal.
nota: Realice la primera incisión en un área relativamente pequeña de la piel para evitar penetrar en la cavidad peritoneal y dañar el tejido intestinal. Continúe la escisión hasta el borde anatómico deseado.
- Identificar el ciego, que es un punto de referencia ideal para la detección del íleon terminal, que constituye el segmento distal del intestino delgado.
nota: El ciego generalmente se encuentra en el lado inferior izquierdo del abdomen del ratón.
- Localice la unión ileocecal, y haga un corte a este nivel lo más distal posible para separar el intestino delgado del ciego. A lo largo de los siguientes pasos, evite el contacto físico excesivo con la pared intestinal porque los PP frágiles colapsan fácilmente al tacto.
- Retire suavemente todo el intestino delgado hasta el esfínter pilórico cortando el mesenterio con unas tijeras. Identifique la unión entre el píloro y el duodeno, y corte el duodeno a este nivel, lo que conducirá al desprendimiento completo del intestino delgado de la cavidad abdominal.
NOTA: (i) Evite la hiperextensión, ya que podría provocar la ruptura de la pared intestinal. (ii) Si se desea el aislamiento de los linfocitos LP además de los linfocitos PP, es necesaria la eliminación completa de la grasa mesentérica. Sin embargo, solo para el aislamiento de PP, la grasa mesentérica restante podría proporcionar algunos beneficios durante los pasos de aislamiento posteriores; por lo tanto, debe conservarse.
- Coloque el intestino delgado desprendido en una placa de 6 pocillos llena de RPMI frío + 10% de suero fetal bovino (FBS) y agite suavemente los tejidos manualmente hasta que todos los segmentos intestinales se sumerjan en el medio frío. Mantenga los pañuelos en hielo durante los siguientes pasos.
- Después de diseccionar el número deseado de intestinos delgados de ratón, proceda a la escisión de PP de los intestinos delgados recolectados.
- Escisión quirúrgica de PPs y preparación de suspensión unicelular:
- Transfiera suavemente el intestino delgado sobre una toalla de papel agarrando la grasa mesentérica con fórceps y colocando el lado mesentérico frente a la toalla de papel. Humedecer todo el segmento intestinal con RPMI frío + 10% FBS para evitar la deshidratación y la pegajosidad de los tejidos.
nota: La grasa mesentérica restante puede ser útil en esta etapa porque los segmentos de tejido graso en el lado mesentérico de la SI se adherirán a la toalla de papel manteniendo el lado antimesentérico hacia arriba.
- Identifique los PP, que aparecen como agregados blancos multilobulados en forma de "coliflor" en el lado antimesentérico de la pared intestinal.
nota: No se recomienda enjuagar el contenido luminal hasta que se hayan extirpado todos los PP. El vaciado del contenido luminal puede provocar el colapso de los PP y evitará el contraste de color entre los PP y la pared intestinal, lo que es muy útil para la identificación visual de los PP.
- Después de identificar los PP en el lado antimeentérico, coloque la tijera quirúrgica de extremo curvo en los PP (la curva debe hacia arriba) reteniendo el PP de su borde distal y proximal.
opcional: Empuje el PP suavemente hacia las hojas de las tijeras con la punta de los dedos. Esta maniobra conducirá a una mejor exclusión del tejido circundante no PP. Extirpe los PP suavemente, excluyendo el tejido intestinal circundante.
NOTA: (i) Este paso es crucial para obtener el máximo rendimiento de células PP y minimizar la contaminación celular de los compartimentos intestinales vecinos, como LP y epitelio intestinal, que también son ricos en células T. (ii) A partir de un SI extirpado de un ratón C57BL/6, se pueden recoger de 5 a 10 PP (tamaño medio, multilobulados). Al apuntar a PP aún más pequeños (no multilobulados), es posible recopilar hasta 12-13 PP por ratón (C57BL/6) utilizando este protocolo.
- Transfiera los PP extirpados a una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos llena de RPMI helado + 10% de FBS y manténgala en hielo con pinzas o tijeras quirúrgicas curvas.
NOTA: (i) Inmediatamente después de la escisión de los PP, la mucosidad y el contenido intestinal en la superficie del PP se pueden limpiar frotando suavemente el pañuelo sobre una toalla de papel. Este paso ayudará a mejorar la viabilidad de los linfocitos PP. (ii) En lugar de transferir los PP a una placa, también se puede considerar la transferencia a tubos separados dependiendo del número total de muestras.
- Opcional: Cuando se completa la escisión de PP y la posterior colocación en la placa de pocillos, el número y el tamaño de los PP recolectados de diferentes grupos experimentales/de ratones se pueden documentar tomando una fotografía de la placa de cultivo de tejidos que contiene PP.
- Prepare un juego de tubos cónicos de 50 mL llenos con 25 mL de RPMI + 10% de FBS (precalentados a 37 °C). Con unas tijeras, corte el borde de una punta de 1.000 μL desde la distancia que permitirá la aspiración de los PP con una pipeta de 1 mL. Aspire los PP con una pipeta de 1 mL y transfiéralos de la placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos a los tubos cónicos de 50 mL preparados.
nota: Utilice una nueva punta para cada muestra de ratón para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.
- Asegure la tapa y coloque los tubos verticalmente en un agitador orbital a 37 °C, con agitación continua a 125-150 rpm durante 10 min. Mientras tanto, prepare un nuevo juego de tubos de 50 mL y coloque un filtro de células de 40 μm en la parte superior de cada tubo, a través del cual se preparará la suspensión de una sola celda.
NOTA: (i) La etapa de agitación eliminará el contenido intestinal restante, el moco y los restos celulares, lo que disminuye la viabilidad celular y la recuperación de los linfocitos PP si no se eliminan. (ii) No aplique ningún tipo de enzimas digestivas en el tejido PP porque el proceso de digestión causa una pérdida dramática de la expresión de CXCR5 de la superficie celular.
- Después de la agitación, transfiera los PP al filtro de células de 40 μm colocado en la parte superior de los tubos cónicos de 50 ml recién preparados. Usando el lado redondeado de un émbolo de jeringa de 10 mL, interrumpa suavemente los PP a través del filtro de celdas para generar una suspensión de una sola celda. Enjuague el colador con 15-20 mL de RPMI frío + 10 % FBS.
NOTA: (i) Antes de filtrar, agite horizontalmente los tubos que contienen los PP. Esta breve agitación facilitará la transferencia de PP a los filtros celulares. (ii) Se recomienda el uso de un filtro de células de 70 μm para el aislamiento de células inmunitarias no linfoides (por ejemplo, monocitos, macrófagos, DC).
- Centrifugar las suspensiones unicelulares a 350-400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células a una concentración de 10 x 106 células/mL. Cuente las células con un hemocitómetro.