Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica de pelajes leucocitarios humanos

Resumen

Fuente: Mily, A., et al. Polarización de células derivadas de monocitos humanos M1 y M2 y análisis con citometría de flujo tras la infección por Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, PBMCs, que contienen monocitos y linfocitos de una capa de leucocitología humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los PBMC aislados se pueden utilizar para un análisis posterior.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de los medios

NOTA: Los detalles sobre todos los reactivos y consumibles se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Medio completo RPMI: Suplemento RPMI 1640 con 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES y 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. Evite los antibióticos en el medio de cultivo celular cuando trabaje con infección por Mtb.
Medio
2. RPMI sin suero: Complemente RPMI 1640 con 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de HEPES.

>2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de pelajes leucocitarios

NOTA: Realice todos los trabajos con sangre humana (potencialmente contagiosa) dentro de una cabina de bioseguridad de clase II. Inactive los productos sanguíneos residuales con desinfectantes durante 15 minutos antes de desecharlos. En este caso, la sangre se obtuvo de voluntarios sanos. Este protocolo de diferenciación de macrófagos in vitro se configuró para incluir 10 x 10⁶ PBMC aislados/donante/pocillo. De cada donante, una capa leucocitaria contiene aproximadamente 50 ml de una suspensión concentrada de leucocitos que se origina en la sangre completa, que normalmente proporciona 500-800 x 10⁶ PBMC de las que se puede extraer aproximadamente el 10% o 50-80 x 10⁶ monocitos.

1. Cargue 15 mL de sangre de capa leucitaria encima de 15 mL de medio de gradiente de densidad preparado en un tubo de 50 mL. Superponga lentamente la sangre sobre la capa de gradiente de densidad inclinando la punta de la pipeta hacia la pared del tubo.
2. Girar los tubos a 600 x g durante 25 min a temperatura ambiente (RT) con 0 aceleración y 0 deceleración.
   nota: Cierre las tapas con cuidado antes de la centrifugación y compruebe siempre si los soportes de los tubos pueden desbordarse después de la centrifugación.
3. Retire la capa superior de plasma con una pipeta Pasteur estéril y, a continuación, recoja cuidadosamente la capa de células mononucleares en un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta Pasteur estéril. Añadir medio RPMI sin suero al pellet de PBMC para obtener un volumen final de 50 mL. Mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo unas cuantas veces antes de la centrifugación a 500 x g durante 5 min a RT.
4. Deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el pellet de la célula volteando la parte inferior del tubo dentro de los dedos.
5. Para eliminar la contaminación del medio de gradiente de densidad de las PBMC, lave las celdas 2-3 veces con RPMI sin suero para obtener un volumen final de 50 mL. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a RT. Lavar hasta que el sobrenadante celular se vuelva transparente.
6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 20 mL de medio RPMI sin suero.
7. Cuente las células mediante tinción con azul de tripán, manualmente con un hemocitómetro o con un contador de células automatizado. Diluya la suspensión celular en azul de tripán en una dilución 1:2 o 1:10 mezclando la muestra de azul de tripán celular en una placa de 96 pocillos, por ejemplo, 50 μL + 50 μL (para el recuento de hemocitómetros) o 10 μL + 10 μL (para el recuento automatizado de células) y cuente las células para obtener el número de células vivas/mL.
   cautela: El azul de tripán es tóxico y debe desecharse en un residuo químico separado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Linfopp	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640	Corporación de Tecnologías de la Vida	SH30096.01
EDTA (0,5 M)	Hospital Universitario Karolinska, Huddinge	N/A
Na-piruvato	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH300239.01
L-Glutamina	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30034.01
HEPES	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30237.01
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524