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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Diferenciación y polarización de células derivadas de monocitos
- Utilice la adherencia plástica para el aislamiento de monocitos. En resumen, siembre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas en una placa de cultivo de 6 pocillos a una concentración adecuada, por ejemplo, 10 x 106 PBMC/pocillo en un medio RPMI libre de suero de 2 mL (Suplemento RPMI 1640 con 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de HEPES) e incube a 37 °C y 5% de CO2.
- Después de 2-3 h, retire las células no adherentes con una pipeta y lave los pocillos 3 veces con 1 ml de medio sin suero. Las células adheridas son monocitos y comprenden alrededor del 10% del total de PBMC añadidas al pocillo, es decir, 106 monocitos recuperados de 10 x 106 PBMC añadidas por pocillo.
- Para la diferenciación de macrófagos, prepare una solución de trabajo que contenga 50 ng/mL GM-CSF o M-CSF para la polarización de macrófagos M1 y M2 respectivamente, añadida en 2 mL de medio completo RPMI por pocillo. Cultive las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 3 días.
- El día 3, retire cuidadosamente 1 mL del medio de cultivo celular de la capa superior de cada pocillo y complemente los cultivos celulares con 1 mL de medio RPMI completo fresco que contenga la concentración doble de M-CSF o GM-CSF para obtener una concentración final de 50 ng/mL en los pocillos. Agregue los factores de crecimiento en una solución de trabajo prefabricada de 100 ng/mL/pocillo.
- En el día 6, agregue diferentes estímulos durante las últimas 18-20 h de diferenciación celular para obtener M1 completamente polarizado y maduro (interferón-γ; IFN-γ y lipopolisacárido; LPS (E. coli O55:B5)) o M2 (interleucina 4; IL-4) macrófagos. Para la polarización M1, prepare IFN-γ y LPS en medio completo RPMI (Suplemento RPMI 1640 con 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES y 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor)) y agregue 50 μL por pocillo para obtener una concentración final de 50 ng/mL de IFN-γ y 10 ng/mL de LPS en los cultivos celulares. Para la polarización M2, prepare IL-4 en medio completo RPMI y agregue 50 μL por pocillo para obtener una concentración final de 20 ng/mL en los cultivos celulares.
- Para la diferenciación de macrófagos polarizados M0, estimule las células solo con M-CSF, sin citocinas adicionales (proporcionando un fenotipo similar a M2).
- Compruebe la morfología de los cultivos celulares derivados de monocitos regularmente con microscopía óptica para asegurarse de que los monocitos más pequeños se diferencian en células más grandes similares a los macrófagos. Además, controle las posibles diferencias morfológicas entre la polarización M1 y M2, es decir, las células M1 alargadas y estiradas en comparación con las células M2 con una forma más redondeada.